Apresentamos um modelo de doença isquêmica do coração utilizando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem, juntamente com um método de avaliação quantitativa dos danos teciduais causados pela isquemia. Este modelo pode fornecer uma plataforma útil para triagem de medicamentos e mais pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.
Doença isquêmica do coração é uma causa significativa de morte em todo o mundo. Tem sido, portanto, objeto de uma enorme quantidade de pesquisas, muitas vezes com modelos de pequenos animais, como roedores. No entanto, a fisiologia do coração humano difere significativamente da do coração roedor, ressaltando a necessidade de modelos clinicamente relevantes para estudar doenças cardíacas. Aqui, apresentamos um protocolo para modelar doenças isquêmicas do coração usando cardiomiócitos diferenciados das células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPS-CMs) e quantificar os danos e o comprometimento funcional dos cardiomiócitos isquêmicos. A exposição a 2% de oxigênio sem glicose e soro aumenta a porcentagem de células feridas, o que é indicado pela coloração do núcleo com iodeto propidium, e diminui a viabilidade celular. Essas condições também diminuem a contratibilidade dos hiPS-CMs, conforme confirmado pela análise de campo vetorial de deslocamento de imagens de vídeo microscópicas. Este protocolo pode, além disso, fornecer um método conveniente para a triagem personalizada de medicamentos, facilitando o uso de células hiPS de pacientes individuais. Portanto, este modelo de doença isquêmica do coração, baseado em iPS-CMs de origem humana, pode fornecer uma plataforma útil para o rastreamento de medicamentos e novas pesquisas sobre doenças isquêmicas do coração.
A doença isquêmica do coração (IC) é reconhecida mundialmente como a principal causa de morte, e foi estimada como responsável por mais de nove milhões de mortes em 20161. A prevalência de doenças cardiovasculares continua a aumentar, e a globalização parece ter contribuído para a prevalência de fatores de risco de doenças cardíacas nos países em desenvolvimento. Portanto, o estudo da IHD está se tornando cada vez mais urgente2.
Modelos experimentais de doenças cardiovasculares são fundamentais para o estudo dos mecanismos da doença, precisão do diagnóstico e desenvolvimento de novas terapias. Vários modelos experimentais foram propostos por muitos laboratórios. É de extrema importância escolher um modelo com vantagens significativas; viabilidade, repetibilidade e similaridade com a doença humana são fatores-chave na seleção dos modelos de doenças cardiovasculares3. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) portadoras de mutações específicas associadas à cardiomiopatia são uma alternativa promissora aos modelos animais4. Embora muitas estratégias tenham sido descritas para induzir cardiomiócitos utilizando iPSCs5,,6,,7,,8,aquifornecemos um método simples para produzir um modelo de IHD utilizando cardiomiócitos diferenciados dos hiPSCs, nos quais não é aplicada a seleção laboriosa de cardiomócito usando marcadores. Neste método, os cardiomiócitos são selecionados funcionalmente pela análise da contração espontânea.
A indução de cardiomiócitos usando hiPSCs evita sacrifício animal e cirurgia tecnicamente difícil. Estabelecer modelos animais de YD requer técnicas cirúrgicas desafiadoras10. Simular perfeitamente os vários aspectos fisiofisiológicos de doenças cardíacas humanas, como a frequência cardíaca e os potenciais de ação da fisiologia dos roedores, é quase impossível. Aliado à moralidade e ética do uso de modelos animais, o desenvolvimento de novos modelos experimentais que não sejam modelos animais é imperativo. Cardiomiócitos diferenciados das células iPS humanas melhor imitam o estado fisiológico do coração humano. Neste protocolo, estabelecemos um modelo de IHD utilizando cardiomiócitos derivados de células hiPS (hiPS-CMs). Em nosso modelo, a privação de oxigênio e glicose leva a uma diminuição da força contratil e da viabilidade dos hiPS-CMs. Nosso método fornece uma nova abordagem para o modelo de IHD e demonstra uma nova plataforma para o estudo dessa doença.
Os pesquisadores frequentemente usam modelos de pequenos animais de laboratório para realizar experimentos de IHD. Aqui, desenvolvemos um modelo de cultura celular de IHD humano para realizar tais experimentos.
O principal problema que um usuário deste protocolo pode enfrentar é a baixa taxa de cardiomiócitos diferenciados. Vários passos devem ser tomados com muito cuidado para melhorar a taxa de diferenciação bem sucedida: (a) ser suave ao pipetar porque as células se desprendem facilmente após a adição das enzimas de dissociação celular reagente, (b) adicionar Y-27632 aumenta a taxa de sobrevivência das células iPS ao se desprender, e (c) o tempo de mudanças médias no início da diferenciação deve ser precisamente 48h de distância para garantir a expressão controlada dos genes envolvidos na diferenciação.
Em relação às proteínas de matriz extracelular utilizadas para o revestimento da superfície da placa de cultura, outros materiais que não a laminina usamos neste protocolo podem ser utilizados. Por exemplo, Matrigel14,15e gelatina16,17 são usados para a cultura de manutenção livre de alimentador de hiPSCs. De acordo com Haraguchi et al., os hiPSCs semeados em Matrigel foram diferenciados com sucesso na folha de células cardíacas18.
Há uma série de estudos anteriores sobre modelos culturais para modelagem de doenças usando cardiomiócitos derivados de hiPSCs. Quanto à modelagem da lesão isquemia-reperfusão, foram introduzidasmanipulaçõesdo ambiente celular, como hipercalemia, acidose e acúmulo de lactato. Outros métodos incluem a pelotização celular para dificultar a difusão de oxigênio20 e a inibição metabólica usando cianeto21. No protocolo atual, a lesão celular foi alcançada por método relativamente simples, ou seja, privação de oxigênio e nutrientes de 24h. No entanto, deve-se tomar cuidado para considerar processos fisiopatológicos precisos da doença isquêmica do coração, pois há de fato diferenças entre a doença in vivo e o modelo de doença do protocolo atual, como a presença ou ausência de ambiente celular tridimensional e sangue.
Quanto ao aspecto tecnológico da avaliação da função cardiomiócito, Toepfer et al. relataram um algoritmo baseado em MatLab para determinar contração e relaxamento de sarcomere em hiPS-CMs22. Smith et al. relataram um método avançado de análise eletrofisiológica de alto rendimento de células excitáveis derivadas de hiPS-CMs, utilizando matrizes multieleditos padronizadas nanotopograficamente sofisticadas23,,24. A vantagem do nosso protocolo é que ele só requer software convencional e consumíveis, como software imageJ e placas de 96 poços.
Com relação ao nível de oxigênio no coração, acredita-se que a pressão de oxigênio nas veias que atingem o coração seja de 40 mmHg25. De acordo com McDougal et al., estima-se que a pressão extracelular de oxigênio sob hipóxia seja <12,8 mmHg26. Aplicando-se o método de Rounds et al.27, calcula-se que a pressão de oxigênio no meio da cultura (salinidade: 35⁄) sob a condição hipoxica (2% de oxigênio) a 37 °C tratada com o protocolo atual é calculada como sendo de 14,9 mmHg, o que é maior do que a estimativa acima. Curiosamente, Al-Ani et al. relataram que há um gradiente de pressão de oxigênio no meio da cultura, e a pressão de oxigênio é afetada pelo tipo celular, densidade de semeadura e volume médio28. Normalmente, a concentração de oxigênio na parte inferior da placa de cultura onde as células residem é a mais baixa. Portanto, o efeito da profundidade no meio da cultura reduziria ainda mais a pressão efetiva de oxigênio perto de hiPS-CMs. Para induzir danos suficientes aos hiPS-CMs usando condição hipóxica, deve-se prestar atenção à profundidade do meio e à densidade das células.
Nosso modelo hiPS-CM, que é muito próximo das condições fisiológicas dos miócitos cardíacos humanos, imita vantajosamente a DIC humana. As abordagens baseadas em modelos animais incluem questões éticas, técnicas e acadêmicas. Particularmente, os modelos in vivo requerem uma técnica avançada de microcirurgia para alcançar dados reprodutíveis: por exemplo, oclusão do ramo descendente anterior da artéria coronária esquerda em roedores3. O modelo hiPS-CM descrito aqui supera essas barreiras críticas e fornece uma plataforma útil, relevante e repetível para doenças cardiovasculares.
No entanto, algumas limitações devem ser observadas. Uma diferença óbvia entre cardiomiócitos induzidos pelo iPS e cardiomiócitos normais é a ausência de T-túbulos29, e não incluímos fatores humorais, como danos teciduais induzidos por leucócitos e ativação de um sistema complementar em nosso estudo. Além disso, deve ser melhorada a taxa de cardiomiócitos diferenciados nesse modelo (20,7 ± 9,6%, Figura Suplementar 3). A recente publicação de Halloin et al. descreve um método escalável e quimicamente definido para induzir a pureza hiPS-CM de >95% por moduladores químicos de vias WNT sem a necessidade de qualquer seleção por marcadores30. No entanto, nosso modelo de IHD humano é relativamente simples e clinicamente aplicável (por exemplo, rastreamento de medicamentos usando células iPS derivadas do paciente). Nosso modelo também é uma plataforma única para elucidar ainda mais mecanismos subjacentes a IHDs.
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi apoiado pelo JSPS KAKENHI, Fundo para a Promoção da Pesquisa Internacional Conjunta (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Os autores agradecem o Laboratório Central de Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de Okayama pela assistência da FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |