Мы представляем модель ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, вместе с методом количественной оценки повреждения тканей, вызванного ишемией. Эта модель может обеспечить полезную платформу для скрининга лекарств и дальнейших исследований ишемической болезни сердца.
Ишемическая болезнь сердца является основной причиной смерти во всем мире. Поэтому он был предметом огромного количества исследований, часто с мелкими животными моделями, такими как грызуны. Тем не менее, физиология человеческого сердца значительно отличается от сердца грызунов, подчеркивая необходимость клинически значимых моделей для изучения сердечных заболеваний. Здесь мы представляем протокол для моделирования ишемической болезни сердца с использованием кардиомиоцитов, дифференцированных от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPS-CMs) и количественной оценки ущерба и функциональных нарушений ишемических кардиомиоцитов. Воздействие 2% кислорода без глюкозы и сыворотки увеличивает процент травмированных клеток, что указывается на окрашивание ядра йодидом пропидия, и снижает клеточную жизнеспособность. Эти условия также снижают контрактность hiPS-CMs, что подтверждается анализом векторных векторов смещения микроскопических видеосъемок. Этот протокол может также обеспечить удобный метод для персонализированного скрининга снадобья путем облегчать пользу клеток hiPS от индивидуальных пациентов. Таким образом, эта модель ишемической болезни сердца, основанная на iPS-CMs человеческого происхождения, может обеспечить полезную платформу для скрининга наркотиков и дальнейших исследований ишемической болезни сердца.
Ишемическая болезнь сердца (ИБС) признана во всем мире в качестве основной причины смерти, и, по оценкам, она несет ответственность за более чем девять миллионов смертельных исходов в 2016году 1. Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний продолжает расти, и глобализация, как представляется, способствовала распространенности факторов риска сердечных заболеваний в развивающихся странах. Таким образом, изучение ИБС становится все более актуальным2.
Экспериментальные модели сердечно-сосудистых заболеваний имеют решающее значение для изучения механизмов заболевания, точности диагностики и разработки новых методов лечения. Многие лаборатории предложили несколько экспериментальных моделей. Крайне важно выбрать модель со значительными преимуществами; осуществимость, повторяемость и сходство с болезнью человека являются ключевыми факторами при выборе моделей сердечно-сосудистыхзаболеваний 3. Человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (гипСК), несущие специфические кардиомиопатия связанных мутаций являются перспективной альтернативой животныхмоделей 4. Хотя многие стратегии были описаны для индуцирования кардиомиоцитовс использованиемiPSCs 5,6,7,8,9, здесь мы предоставляем простой метод для производства модели IHD с использованием кардиомиоцитов отличается от hiPSCs, в котором трудоемкий выбор кардиомиоцитов с использованием маркеров не применяется. В этом методе, кардиомиоциты выбираются функционально путем анализа спонтанного сокращения.
Индукция кардиомиоцитов с использованием hiPSCs позволяет избежать жертвоприношений животных и технически сложной хирургии. Создание животных моделей IHD требует сложных хирургическихметодов 10. Идеально имитировать различные патофизиологические аспекты сердечных заболеваний человека, такие как пульс и потенциал действия от физиологии грызунов практически невозможно. В сочетании с моралью и этикой использования моделей животных, разработка новых экспериментальных моделей, помимо моделей животных, является настоятельной необходимостью. Кардиомиоциты, дифференцированные от клеток iPS человека, лучше имитируют физиологическое состояние сердца человека. В этом протоколе мы устанавливаем модель ИБС с использованием кардиомиоцитов, полученных из клеток hiPS (hiPS-CMs). В нашей модели лишение кислорода и глюкозы приводит к снижению контрактной силы и жизнеспособности hiPS-CMs. Наш метод обеспечивает новый подход к модели IHD и демонстрирует новую платформу для изучения этого заболевания.
Исследователи часто используют лабораторные модели малых животных для проведения экспериментов с ИБС. Здесь мы разработали модель клеточной культуры человеческого ИБС для проведения таких экспериментов.
Основная проблема, с которой может столкнуться пользователь этого протокола, это низкий уровень дифференцированных кардиомиоцитов. Несколько шагов следует предпринять с большой осторожностью, чтобы улучшить скорость успешной дифференциации: а) быть нежным, когда пипетки, потому что клетки легко отделить после добавления реагента ферментов диссоциации клеток, (б) добавление Y-27632 увеличивает выживаемость клеток iPS при отсоединения, и (с) сроки средних изменений в начале дифференциации должны быть точно 48 ч друг от друга, чтобы обеспечить контролируемое выражение генов, участвующих в дифференциации.
Что касается внеклеточных белков матрицы, используемых для покрытия поверхности пластины культуры, другие материалы, чем ламинин мы использовали в этом протоколе могут быть использованы. Например, Matrigel14,15, ижелатин 16,17 используются для подачи свободной культуры обслуживания hiPSCs. Согласно Haraguchi et al., hiPSCs посеянные на Matrigel успешно были продифференцированы в лист сердечной клетки18.
Есть ряд предыдущих исследований, касающихся моделей культуры для моделирования заболеваний с использованием кардиомиоцитов, полученных из hiPSCs. Что касается моделирования ишемии-реперфузии травмы, манипуляции клеточной среды, такие как гиперкалиемия, ацидоз, и накоплениелактата, были введены 19. Другие методы включают гранулирование клеток, чтобы препятствовать распространению кислорода20 и метаболические ингибирования с использованиемцианида 21. В текущем протоколе, повреждение клеток было достигнуто относительно простым методом, а именно 24 ч лишения кислорода и питательных веществ. Однако следует позаботиться о точных патофизиологических процессах ишемической болезни сердца, так как действительно существуют различия между болезнью in vivo и моделью заболевания текущего протокола, такие как наличие или отсутствие трехмерной клеточной среды и крови.
Что касается технологического аспекта оценки функции кардиомиоцитов, Toepfer et al. сообщили о алгоритме на основе MatLab для определения саркомерного сокращения и релаксации в hiPS-CMs22. Smith et al. сообщили о передовом методе высокопрофильного электрофизиологического анализа возбудимых клеток, полученных из hiPS-CMs, используя сложные нанотопографически узорчатые многоэлектрозныемассивы 23,24. Преимущество нашего протокола в том, что он требует только обычного программного обеспечения и расходных материалов, таких как программное обеспечение ImageJ и 96-колодец пластин.
Что касается уровня кислорода в сердце, давление кислорода в венах, которые достигают сердца, как полагают, 40 мм рт.ст. 25. По данным McDougal et al., внеклеточное давление кислорода при гипоксии оценивается в 12,8 мм рт.ст. Применяя метод Раундов и др.27, давление кислорода в среде культуры (соленость: 35‰) при гипоксической состоянии (2% кислорода) при 37 градусах Цельсия, обработанных текущим протоколом, рассчитывается на уровне 14,9 мм рт. ст., что выше выше выше оценки выше. Интересно, что Аль-Ани и др. сообщили, что существует градиент кислородного давления в среде культуры, и давление кислорода зависит от типа клеток, плотности посева, исредний объем 28. Как правило, концентрация кислорода в нижней части пластины культуры, где находятся клетки, является самой низкой. Таким образом, эффект глубины в среде культуры будет еще больше снизить эффективное давление кислорода вблизи hiPS-CMs. Для того, чтобы вызвать достаточный ущерб hiPS-CMs с использованием гипоксического состояния, пристальное внимание должно быть уделено глубине среды и плотности клеток.
Наша модель hiPS-CM, которая очень близка к физиологическим условиям сердечных миоцитов человека, выгодно имитирует ИБС человека. Подходы, основанные на модели животных, включают этические, технические и академические вопросы. В частности, в моделях in vivo требуется передовая методика микрохирургии для достижения воспроизводимых данных: например, окклюзия передней нисходящей ветви левой коронарной артерии угрызунов 3. Описанная в настоящем случае модель hiPS-CM преодолевает эти критические барьеры и обеспечивает полезную, релевантную и повторяемую платформу для сердечно-сосудистых заболеваний.
Однако следует отметить некоторые ограничения. Очевидная разница между iPS-индуцированных кардиомиоцитов и нормальных кардиомиоцитов является отсутствиеТ-труб 29, и мы не включают гуморальные факторы, такие как повреждение тканей, вызванных лейкоцитов и активации системы дополнения в нашем исследовании. Кроме того, следует улучшить скорость дифференцированных кардиомиоцитов в этой модели (20,7 ± 9,6%, дополнительный рисунок 3). Недавняя публикация Halloin et al. описывает масштабируемый, химически определенный метод, чтобы вызвать чистоту hiPS-CM в размере 95% от химических модуляторов пути WNT без требования какого-либо выбора маркерами30. Тем не менее, наша модель ИБС человека относительно проста и клинически применима (например, скрининг на наркотики с использованием клеток iPS, полученных пациентом). Наша модель также является уникальной платформой для дальнейшего выяснения механизмов, лежащих в основе IHD.
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было поддержано JSPS KAKENHI, Фондом содействия совместным международным исследованиям (Fostering Joint International Research), 17KK0168. Авторы с благодарностью признают Центральную исследовательскую лабораторию, Медицинскую школу Университета Окаяма за помощь FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |