نقدم نموذجًا لأمراض القلب الإقفارية باستخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان، إلى جانب طريقة للتقييم الكمي لتلف الأنسجة الناجم عن نقص التروية. يمكن أن يوفر هذا النموذج منصة مفيدة لفحص المخدرات والمزيد من البحوث حول أمراض القلب الإقفارية.
مرض القلب الإقفاري هو سبب كبير للوفاة في جميع أنحاء العالم. ولذلك كان موضوع كمية هائلة من البحوث، وغالبا مع نماذج الحيوانات الصغيرة مثل القوارض. ومع ذلك ، فإن فسيولوجيا قلب الإنسان تختلف اختلافا كبيرا عن قلب القوارض ، مما يؤكد الحاجة إلى نماذج ذات صلة سريريا لدراسة أمراض القلب. هنا، نقدم بروتوكولا لنموذج مرض القلب الإقفائي باستخدام cardiomyocytes متمايزة عن الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPS-CMs) وتحديد الضرر والإعاقة الوظيفية للقلب الإقفاري. التعرض ل 2٪ الأكسجين دون الجلوكوز والمصل يزيد من نسبة الخلايا المصابة، والتي يشار إليها عن طريق تلطيخ النواة مع يوديد بروبيد، ويقلل من الجدوى الخلوية. كما تقلل هذه الشروط من قابلية قابلية قابلية hiPS-CMs كما أكدها تحليل حقل النزوح في مجال الصور المرئية المجهرية. علاوة على ذلك قد يوفر هذا البروتوكول طريقة مريحة لفحص الأدوية الشخصية من خلال تسهيل استخدام خلايا هيبس من المرضى الفرديين. ولذلك، فإن هذا النموذج من أمراض القلب الإقفاري، استنادا إلى iPS-CMs من أصل بشري، يمكن أن توفر منصة مفيدة لفحص المخدرات ومزيد من البحوث حول أمراض القلب الإقفاري.
مرض القلب الإقفاري (IHD) معترف به في جميع أنحاء العالم كسبب رئيسي للوفاة، وكان من المقدر أن يكون مسؤولا عن أكثر من تسعة ملايين حالة وفاة في عام 20161. ولا يزال انتشار أمراض القلب والأوعية الدموية في ارتفاع، ويبدو أن العولمة قد أسهمت في انتشار عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب في البلدان النامية. ولذلك، فإن دراسة IHD أصبحت أكثر إلحاحا على نحو متزايد2.
النماذج التجريبية لأمراض القلب والأوعية الدموية حاسمة لدراسة آليات المرض، ودقة التشخيص، وتطوير علاجات جديدة. وقد اقترحت العديد من المختبرات عدة نماذج تجريبية. ومن الأهمية بمكان اختيار نموذج ذي مزايا هامة؛ الجدوى والتكرار والتشابه مع الأمراض البشرية هي عوامل رئيسية في اختيار نماذج أمراض القلب والأوعية الدموية3. الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) التي تحمل طفرات محددة مرتبطة باعتلال عضلة القلب هي بديل واعد للنماذج الحيوانية4. على الرغم من أن العديد من الاستراتيجيات قد وصفت لتحفيز cardiomyocytes باستخدام iPSCs5,6,7,8,9, هنا نقدم طريقة بسيطة لإنتاج نموذج IHD باستخدام cardiomyocytes تختلف عن hiPSCs, في اختيار شاقة من cardiomyocyte باستخدام علامات لا يتم تطبيقها. في هذه الطريقة، يتم اختيار cardiomyocytes وظيفيا عن طريق تحليل الانكماش التلقائي.
تحريض cardiomyocytes باستخدام hiPSCs يتجنب التضحية الحيوانية والجراحة الصعبة من الناحية الفنية. إنشاء نماذج حيوانية من IHD يتطلب تقنيات جراحية التحدي10. محاكاة تماما الجوانب المختلفة الفيزيولوجية الباثولوجية لأمراض القلب البشرية مثل معدل ضربات القلب وإمكانات العمل من علم وظائف الأعضاء من القوارض يكاد يكون من المستحيل. وإلى جانب أخلاق وأخلاقيات استخدام النماذج الحيوانية، لا بد من وضع نماذج تجريبية جديدة غير النماذج الحيوانية. Cardiomyocytes متباينة من الخلايا iPS الإنسان أفضل تقليد الحالة الفسيولوجية للقلب البشري. في هذا البروتوكول، ونحن إنشاء نموذج من IHD باستخدام cardiomyocytes المستمدة من خلايا هيبس (هيبس-CMs). في نموذجنا ، يؤدي الحرمان من الأكسجين والجلوكوز إلى انخفاض في القوة المتعاقدة وقابلية البقاء لـ hiPS-CMs. يوفر أسلوبنا نهجًا جديدًا لنموذج IHD ويوضح منصة جديدة لدراسة هذا المرض.
غالباً ما يستخدم الباحثون نماذج الحيوانات الصغيرة المختبرية لإجراء تجارب IHD. هنا، طورنا نموذج ثقافة الخلية من IHD الإنسان لإجراء مثل هذه التجارب.
المشكلة الرئيسية التي قد يواجهها المستخدم لهذا البروتوكول هو انخفاض معدل عضلة القلب المختلفة. وينبغي اتخاذ عدة خطوات مع الحرص الشديد على تحسين معدل التمايز الناجح: (أ) أن تكون لطيف عند الأنابيب لأن الخلايا بسهولة فصل بعد إضافة إنزيمات تفكك الخلايا الكاشفة، (ب) إضافة Y-27632 يزيد من معدل البقاء على قيد الحياة من الخلايا iPS عند فصل، و (ج) توقيت التغيرات المتوسطة في بداية التمايز يجب أن يكون بالضبط 48 ح بعيدا لضمان التعبير عن السيطرة على الجينات المشاركة في التمايز.
فيما يتعلق بروتينات المصفوفة خارج الخلية المستخدمة لطلاء سطح لوحة الثقافة، يمكن استخدام مواد أخرى من اللامينيين التي استخدمناها في هذا البروتوكول. على سبيل المثال، تستخدم Matrigel14و15و الجيلاتين16و17 لثقافة الصيانة الخالية من التغذية من الهيكس. وفقا لهاراغوتشي وآخرون، تم تمييز hiPSCs المصنفة على Matrigel بنجاح في ورقة خلايا القلب18.
هناك عدد من الدراسات السابقة بشأن نماذج الثقافة لنمجة الأمراض باستخدام cardiomyocytes المستمدة من hiPSCs. وفيما يتعلق بالنمذجة من إصابة الإقفاريات reperfusion، التلاعب في البيئة الخلوية، مثل فرط بوتاسيوم الدم، والحمض، وتراكم اللاكتات، وقد أدخلت19. وتشمل الأساليب الأخرى بيليه الخلية لإعاقة انتشار الأكسجين20 وتثبيط الأيض باستخدام السيانيد21. في البروتوكول الحالي ، تم تحقيق إصابة الخلايا بطريقة بسيطة نسبيًا ، وهي حرمان 24 ساعة من الأكسجين والمواد المغذية. ومع ذلك ، ينبغي الحرص على النظر في العمليات الدقيقة فيزيائية المرضية من مرض القلب الإقفاري ، كما أن هناك اختلافات بين المرض في الجسم الحي ونموذج المرض للبروتوكول الحالي ، مثل وجود أو عدم وجود بيئة خلوية ثلاثية الأبعاد والدم.
فيما يتعلق بالجانب التكنولوجي لتقييم وظيفة cardiomyocyte، أبلغ Toepfer وآخرون خوارزمية MatLab مقرها لتحديد انكماش الساركومير والاسترخاء في hiPS-CMs22. سميث وآخرون ذكرت طريقة متقدمة من التحليل الكهربائي عالية الإنتاجية من الخلايا القابلة للإثارة المستمدة من HIPS-CMs، وذلك باستخدام متطورة nanotopographically منقوشة متعددة الأقطاب صفائف multielectrode23،24. وميزة بروتوكولنا هو أنه يتطلب فقط البرمجيات التقليدية والمواد الاستهلاكية، مثل برنامج imageJ ولوحات 96-جيدا.
فيما يتعلق بمستوى الأكسجين في القلب، يُعتقد أن ضغط الأكسجين في الأوردة التي تصل إلى القلب يبلغ 40 مم زئبق25. وفقا لMcDougal وآخرون، ويقدر ضغط الأكسجين خارج الخلية تحت نقص الأكسجة أن يكون < 12.8 مم زئبق26. عن طريق تطبيق طريقة جولات وآخرون27، يتم حساب ضغط الأكسجين في الوسط الثقافة (الملوحة: 35%)) تحت حالة نقص الأكسجين (2٪ الأوكسجين) في 37 درجة مئوية تعامل مع البروتوكول الحالي لتكون 14.9 مم زئبق، وهو أعلى من التقدير أعلاه. ومن المثير للاهتمام أن العاني وآخرون أفادوا أن هناك تدرج ضغط الأكسجين في الوسط الثقافي، ويتأثر ضغط الأكسجين بنوع الخلية وكثافة البذر والحجم المتوسط28. عادة، تركيز الأكسجين في الجزء السفلي من لوحة الثقافة حيث تتواجد الخلايا هو أدنى. ولذلك، فإن تأثير العمق في الوسط ثقافة زيادة خفض ضغط الأكسجين الفعال بالقرب من هيبس-CMs. من أجل إحداث ضرر كاف لـ hiPS-CMs باستخدام حالة نقص الأكسجين ، يجب إيلاء اهتمام دقيق لعمق الخلايا المتوسطة وكثافة الخلايا.
لدينا نموذج HIPS-CM، وهو قريب جدا من الظروف الفسيولوجية من myocytes القلبية البشرية، يحاكي بشكل مفيد IHD الإنسان. وتشمل المناهج المستندة إلى نماذج الحيوان القضايا الأخلاقية والتقنية والأكاديمية. بشكل خاص، في نماذج vivo تتطلب تقنية متقدمة من الجراحة المجهرية لتحقيق بيانات قابلة للاستنساخ: على سبيل المثال، انسداد الفرع التنازلي الأمامي من الشريان التاجي الأيسر في القوارض3. يتغلب نموذج HIPS-CM الموصوف هنا على هذه الحواجز الحرجة ويوفر منصة مفيدة وملائمة وقابلة للتكرار لأمراض القلب والأوعية الدموية.
غير أنه ينبغي ملاحظة بعض القيود. وهناك فرق واضح بين أمراض القلب التي يسببها iPS والقلبية العادية هي عدم وجود تي-أنابيب29، ونحن لم تشمل العوامل الخلطية مثل تلف الأنسجة الناجمة عن الكريات البيض وتنشيط نظام مكمل في دراستنا. وعلاوة على ذلك, ينبغي تحسين معدل عضلة القلب المختلفة في هذا النموذج (20.7 ± 9.6%, الشكل التكميلي 3). يصف المنشور الأخير من قبل Halloin وآخرون طريقة قابلة للتطوير ومحددة كيميائيًا للحث على نقاء HIPS-CM من > 95٪ بواسطة محفزات مسار WNT الكيميائية دون اشتراط أي اختيار بواسطة علامات30. ومع ذلك، نموذجنا من IHD الإنسان بسيط نسبيا وقابلة للتطبيق سريريا (على سبيل المثال، فحص المخدرات باستخدام الخلايا iPS المستمدة من المريض). نموذجنا هو أيضا منصة فريدة من نوعها لزيادة توضيح الآليات الكامنة في IHDs.
The authors have nothing to disclose.
وقد دعمت هذه الدراسة JSPS KAKENHI، صندوق تعزيز البحوث الدولية المشتركة (تعزيز البحوث الدولية المشتركة)، 17KK0168. الكتاب ممتنين الاعتراف مختبر البحوث المركزية ، كلية الطب جامعة أوكاياما لمساعدة FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |