אנו מציגים מודל של מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes נגזר תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם, יחד עם שיטה להערכה כמותית של נזק לרקמות הנגרמת על ידי איסכמיה. מודל זה יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.
מחלת לב איסכמית היא גורם משמעותי למוות ברחבי העולם. לכן זה היה הנושא של כמות עצומה של מחקר, לעתים קרובות עם מודלים בעלי חיים קטנים כגון מכרסמים. עם זאת, הפיזיולוגיה של הלב האנושי שונה באופן משמעותי מזה של הלב המכרסם, מדגיש את הצורך במודלים רלוונטיים קלינית כדי ללמוד מחלות לב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למודל מחלת לב איסכמית באמצעות cardiomyocytes מובדיל מתאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPS-CMs) ולכמת את הנזק ואת הפגיעה התפקודית של cardiomyocytes איסכמי. חשיפה ל-2% חמצן ללא גלוקוז וסרום מגדילה את אחוז התאים הפצועים, אשר מצוין על ידי הכתמת הגרעין עם פרודיד פרופידיום, ומפחית את הכדאיות התאית. תנאים אלה גם להקטין את ההתכווצות של hiPS-CMs כפי שאושר על ידי ניתוח שדה וקטורי עקירה של תמונות וידאו מיקרוסקופיות. פרוטוקול זה עשוי לספק גם שיטה נוחה לסינון תרופות מותאמות אישית על ידי הקלת השימוש בתאי hiPS מחולים בודדים. לכן, מודל זה של מחלת לב איסכמית, המבוסס על iPS-CMs ממוצא אנושי, יכול לספק פלטפורמה שימושית לסינון תרופות ומחקר נוסף על מחלות לב איסכמיות.
מחלת לב איסכמית (IHD) מוכרת ברחבי העולם כגורם המוות המוביל, וההערכה היא כי היא אחראית ליותר מתשעה מיליון הרוגים בשנת 20161. השכיחות של מחלות לב וכלי דם ממשיכה לעלות, ונראה שהגלובליזציה תרמה לשכיחות של גורמי סיכון למחלות לב במדינות מתפתחות. לכן, המחקר של IHD הופך יותר ויותרדחוף 2.
מודלים ניסיוניים של מחלות לב וכלי דם הם קריטיים לחקר מנגנוני המחלה, דיוק האבחון, ופיתוח של טיפולים חדשים. מספר מודלים ניסיוניים הוצעו על ידי מעבדות רבות. יש חשיבות עליונה לבחור מודל עם יתרונות משמעותיים; היתכנות, חזרה ודמיון למחלות אנושיות הם גורמי מפתח בבחירה של מודלים למחלות לב וכלידם 3. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (hiPSCs) הנושאים מוטציות ספציפיות הקשורות לקרדיומיופתיה הם אלטרנטיבה מבטיחה למודלים של בעלי חיים4. למרות אסטרטגיות רבות תוארו עבור קרדיומיוציטים גורם iPSCs5,6,77,8,9 , כאן אנומספקים שיטהפשוטה כדי לייצר מודל IHD באמצעות cardiomyocytes מובדיל hiPSCs, שבו מבחר מייגע של cardiomyocyte באמצעות סמנים אינו מיושם. בשיטה זו, cardiomyocytes נבחרים באופן פונקציונלי על ידי ניתוח התכווצות ספונטנית.
אינדוקציה של cardiomyocytes באמצעות hiPSCs מונע הקרבה בעלי חיים וניתוח קשה מבחינה טכנית. הקמת מודלים של בעלי חיים של IHD דורשת טכניקות כירורגיות מאתגרות10. הדמיה מושלמת של ההיבטים הפתופיזיולוגיים השונים של מחלות לב אנושיות כגון קצב לב ופוטנציאל פעולה מהפיזיולוגיה של מכרסמים היא כמעט בלתי אפשרית. יחד עם המוסריות והאתיקה של שימוש במודלים של בעלי חיים, פיתוח מודלים ניסיוניים חדשים מלבד מודלים של בעלי חיים הוא הכרחי. קרדיומיוציטים מובדילים מתאי IPS אנושיים לחקות טוב יותר את המצב הפיזיולוגי של הלב האנושי. בפרוטוקול זה, אנו מקימים מודל של IHD באמצעות cardiomyocytes נגזר מתאי hiPS (hiPS-CMs). במודל שלנו, מניעת חמצן וגלוקוז מובילה לירידה בכוח ההתכווצות ובכדאיות של hiPS-CMs. השיטה שלנו מספקת גישה חדשה למודל IHD ומדגימה פלטפורמה חדשה לחקר המחלה.
חוקרים משתמשים לעתים קרובות במודלים של בעלי חיים קטנים במעבדה כדי לערוך ניסויי IHD. כאן, פיתחנו מודל תרבות תאים של IHD אנושי כדי לבצע ניסויים כאלה.
הבעיה העיקרית שמשתמש בפרוטוקול זה עשוי להתמודד היא שיעור נמוך של cardiomyocytes מופלל. מספר צעדים יש לנקוט בזהירות רבה כדי לשפר את קצב ההבידול המוצלח: (א) להיות עדין בעת pipetting כי התאים בקלות להתנתק לאחר תוספת של reagent אנזימי דיסוציאציה התא, (ב) הוספת Y-27632 מגבירה את שיעור ההישרדות של תאי iPS בעת ניתוק, ו-(ג) התזמון של שינויים בינוניים בתחילת ההבידול צריך להיות בדיוק 48 שעות זה מזה כדי להבטיח ביטוי מבוקר של גנים המעורבים בידול.
לגבי חלבוני מטריצה חוץ תאיים המשמשים לציפוי פני השטח של צלחת תרבות, חומרים אחרים מאשר למינין שהשתמשנו בפרוטוקול זה יכולים לשמש. לדוגמה, Matrigel14,15וג’לטין16,17 משמשים לתרבות התחזוקה ללא מאכילים של hiPSCs. על פי Haraguchi ואח ‘, hiPSCs זרעו על Matrigel היו בהצלחה הבדיל לתוך גיליון תא לב18.
ישנם מספר מחקרים קודמים לגבי מודלים תרבותיים עבור מידול מחלה באמצעות cardiomyocytes נגזר hiPSCs. לגבי מידול של פגיעה איסכמיה-reperfusion, מניפולציות של הסביבה התאית, כגון היפרקלמיה, חסה, והצטברות הקטאט,הוצגו 19. שיטות אחרות כוללות כדוריות תאים כדי לעכב את דיפוזיהחמצן 20 ועיכוב חילוף החומרים באמצעות ציאניד21. בפרוטוקול הנוכחי, פגיעה בתא הושגה על ידי שיטה פשוטה יחסית, כלומר 24 h מחסור של חמצן וחומרים מזינים. עם זאת, יש לנקוט בטיפול כדי לשקול תהליכים פתופיזיולוגיים מדויקים של מחלת הלב האיסכמית, כפי שאכן יש הבדלים בין המחלה vivo מודל המחלה של הפרוטוקול הנוכחי, כגון נוכחות או היעדר של סביבה תאית תלת מימדית ודם.
לגבי ההיבט הטכנולוגי של הערכת תפקוד cardiomyocyte, Toepfer ואח’ דיווח אלגוריתם מבוסס MatLab כדי לקבוע התכווצות sarcomere והרפיה hiPS-CMs22. סמית’ דיווח על שיטה מתקדמת של ניתוח אלקטרופיזיולוגי בתפוקה גבוהה של תאים מעוררי רגש הנגזרים מ-hiPS-CMs, תוך שימוש במערכים רב-תכליתיים מתוחכמים בעלידוגמאות ננוטופוגרפיות 23,,24. היתרון של הפרוטוקול שלנו הוא שזה דורש רק תוכנה קונבנציונלית חומרים מתכלים, כגון תוכנת imageJ וצלחות 96-באר.
ביחס לרמת החמצן בלב, לחץ החמצן בורידים שמגיעים ללב נחשב 40 mmHg25. על פי מקדוגל ואח ‘, לחץ חמצן חוץ תאי תחת היפוקסיה מוערך להיות <12.8 mmHg26. על ידי החלת השיטה של סיבובים ואח’27 , לחץ החמצןבמדיום התרבות (מליחות: 35,) תחת המצב hypoxic (2% חמצן) ב 37 °C מטופל עם הפרוטוקול הנוכחי מחושב להיות 14.9 mmHg, שהוא גבוה יותר מאשר ההערכה לעיל. באופן מעניין, דיווח אל-אני ואח’ כי יהיה הדרגתי של לחץ חמצן במדיום התרבות, ולחץ החמצן מושפע מסוג התא, מצפיפות הזרעים ובנפחבינוני 28. בדרך כלל, ריכוז החמצן בתחתית צלחת התרבות שבה תאים מתגוררים הוא הנמוך ביותר. לכן, ההשפעה של עומק במדיום התרבות תפחית עוד יותר את לחץ החמצן היעיל ליד hiPS-CMs. על מנת לגרום נזק מספיק hiPS-CMs באמצעות מצב היפוקסי, יש לשלם תשומת לב זהירה לעומק של בינוני וצפיפות של תאים.
דגם hiPS-CM שלנו, אשר קרוב מאוד לתנאים הפיזיולוגיים של מיוציטים לב אנושיים, מחקה יתרון IHD אנושי. גישות מבוססות מודל של בעלי חיים כוללות סוגיות אתיות, טכניות ואקדמיות. במיוחד, במודלים vivo דורשים טכניקה מתקדמת של מיקרוכירורגיה כדי להשיג נתונים לשחזור: למשל, חסימה של הענף הקדמי יורד של העורק הכלילי השמאלימכרסמים 3. דגם hiPS-CM המתואר בזאת מתגבר על מחסומים קריטיים אלה ומספק פלטפורמה שימושית, רלוונטית וחוזרת על עצמה למחלות לב וכלי דם.
עם זאת, יש ל ציין כמה מגבלות. הבדל ברור בין cardiomyocytes המושרה על ידי IPS ו cardiomyocytes נורמלי הוא היעדר T-tubules29, ואנחנו לא כוללים גורמים הומוריסטיים כגון נזק לרקמות המושרה על ידי leukocytes והפעלה של מערכת משלימה במחקר שלנו. יתר על כן, שיעור cardiomyocytes מופללים במודל זה (20.7 ± 9.6%, דמות משלימה 3)יש לשפר. הפרסום האחרון על ידי Halloin ואח ‘מתאר מדרגי, שיטה כימית מוגדרת כדי לגרום hiPS-CM טוהר של >95% על ידי אפנונים מסלול WNT כימי ללא דרישה של כל בחירה על ידי סמנים30. אף על פי כן, המודל שלנו של IHD אנושי הוא פשוט יחסית וישים קלינית (למשל, סינון תרופות באמצעות תאי IPS נגזר המטופל). המודל שלנו הוא גם פלטפורמה ייחודית להכללת מנגנונים בסיסיים של מזהי IHD.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI, הקרן לקידום מחקר בינלאומי משותף (טיפוח מחקר בינלאומי משותף), 17KK0168. המחברים מכירים בהכרת תודה מעבדת המחקר המרכזית, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אוקאיאמה לסיוע של FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |