Wir präsentieren ein Modell der ischämischen Herzkrankheit mit Kardiomyozyten aus humaninduzierten pluripotenten Stammzellen, zusammen mit einer Methode zur quantitativen Bewertung von Gewebeschäden, die durch Ischämie verursacht werden. Dieses Modell kann eine nützliche Plattform für das Screening von Arzneimitteln und weitere Forschung endemische Herzkrankheiten bieten.
Ischämische Herzerkrankungen sind weltweit eine bedeutende Todesursache. Es wurde daher sehr viel erforscht, oft mit Kleintiermodellen wie Nagetieren. Die Physiologie des menschlichen Herzens unterscheidet sich jedoch deutlich von der des Nagetierherzens, was die Notwendigkeit klinisch relevanter Modelle zur Untersuchung von Herzerkrankungen unterstreicht. Hier stellen wir ein Protokoll zur Modellierung ischämischer Herzerkrankungen mit Kardiomyozyten vor, die sich von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-CMs) unterscheiden, und um die Schäden und funktionellen Beeinträchtigungen der ischämischen Kardiomyozyten zu quantifizieren. Die Exposition gegenüber 2% Sauerstoff ohne Glukose und Serum erhöht den Prozentsatz der verletzten Zellen, der durch Färbung des Zellkerns mit Propidiumjodid angezeigt wird, und verringert die zelluläre Lebensfähigkeit. Diese Bedingungen verringern auch die Kontraktilität von hiPS-CMs, wie durch die Verschiebungsvektorfeldanalyse von mikroskopischen Videobildern bestätigt. Dieses Protokoll kann darüber hinaus eine praktische Methode für personalisierte Arzneimittelscreenings bieten, indem es die Verwendung von HiPS-Zellen von einzelnen Patienten erleichtert. Daher kann dieses Modell der ischämischen Herzkrankheit, das auf iPS-CMs menschlichen Ursprungs basiert, eine nützliche Plattform für das Screening von Medikamenten und weitere Forschungen über ischämische Herzerkrankungen bieten.
Die ischämische Herzkrankheit (IHD) ist weltweit als die häufigste Todesursache anerkannt und wurde 2016 auf mehr als neun Millionen Todesfälle geschätzt1. Die Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen nimmt weiter zu, und die Globalisierung scheint zur Prävalenz von Risikofaktoren für Herzkrankheiten in Entwicklungsländern beigetragen zu haben. Daher wird die Studie von IHD immer dringlicher2.
Experimentelle Modelle von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind entscheidend für die Untersuchung der Mechanismen von Krankheiten, Genauigkeit der Diagnose, und die Entwicklung neuer Therapien. Viele Laboratorien haben mehrere experimentelle Modelle vorgeschlagen. Es ist von größter Bedeutung, ein Modell mit erheblichen Vorteilen zu wählen; Machbarkeit, Wiederholbarkeit und Ähnlichkeit mit menschlichen Krankheiten sind Schlüsselfaktoren bei der Auswahl von Herz-Kreislauf-Erkrankungen Modelle3. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (HiPSCs), die spezifische Kardiomyopathie-assoziierte Mutationen tragen, sind eine vielversprechende Alternative zu Tiermodellen4. Obwohl viele Strategien zur Induktion von Kardiomyozyten mit iPSCs5,6,7,8,9beschrieben wurden, bieten wir hier eine einfache Methode zur Herstellung eines IHD-Modells mit Kardiomyozyten, die sich von hiPSCs unterscheiden, bei denen eine mühsame Auswahl von Kardiomyozyten mit Markern nicht angewendet wird. Bei dieser Methode werden Kardiomyozyten funktionell durch die Analyse der spontanen Kontraktion ausgewählt.
Die Induktion von Kardiomyozyten mit HiPSCs vermeidet Tieropfer und technisch schwierige Operationen. Die Erstellung von Tiermodellen von IHD erfordert anspruchsvolle chirurgische Techniken10. Eine perfekte Simulation der verschiedenen pathophysiologischen Aspekte menschlicher Herzkrankheiten wie Herzfrequenz und Wirkungspotentiale aus der Physiologie von Nagetieren ist fast unmöglich. In Verbindung mit der Moral und Ethik der Verwendung von Tiermodellen ist die Entwicklung neuer experimenteller Modelle, die nicht Tiermodelle sind, unerlässlich. Kardiomyozyten, die von menschlichen iPS-Zellen unterschieden werden, imitieren besser den physiologischen Zustand des menschlichen Herzens. In diesem Protokoll erstellen wir ein Modell der IHD mit Kardiomyozyten, die von HiPS-Zellen (hiPS-CMs) abgeleitet sind. In unserem Modell führt der Entzug von Sauerstoff und Glukose zu einer Abnahme der kontraktilen Kraft und Der Lebensfähigkeit von hiPS-CMs. Unsere Methode bietet einen neuen Ansatz für das Modell IHD und zeigt eine neue Plattform für die Untersuchung dieser Krankheit.
Forscher verwenden häufig Labor-Kleintiermodelle, um IHD-Experimente durchzuführen. Hier haben wir ein Zellkulturmodell des menschlichen IHD entwickelt, um solche Experimente durchzuführen.
Das Hauptproblem, mit dem ein Benutzer dieses Protokolls konfrontiert sein kann, ist eine niedrige Rate differenzierter Kardiomyozyten. Es sollten mehrere Schritte unternommen werden, um die Rate der erfolgreichen Differenzierung zu verbessern: (a) beim Pipetieren sanft sein, da sich die Zellen nach Zugabe der Zelldissoziationsenzyme Reagenz leicht lösen, (b) die Zugabe von Y-27632 die Überlebensrate von iPS-Zellen beim Lösen erhöht und (c) das Timing von mittleren Veränderungen zu Beginn der Differenzierung genau 48 h auseinander liegen sollte, um eine kontrollierte Expression von Genen zu gewährleisten, die an der Differenzierung beteiligt sind.
In Bezug auf die extrazellulären Matrixproteine, die für die Beschichtung der Oberfläche der Kulturplatte verwendet werden, können andere Materialien als Laminin verwendet werden, die wir in diesem Protokoll verwendet haben. Zum Beispiel werden Matrigel14,15und Gelatine16,17 für die feederfreie Wartungskultur von hiPSCs verwendet. Nach Haraguchi et al. wurden auf Matrigel gesäte HiPSCs erfolgreich in Herzzellblatt18unterschieden.
Es gibt eine Reihe von früheren Studien über Kulturmodelle für die Krankheitsmodellierung mit Kardiomyozyten, die von hiPSCs abgeleitet sind. In Bezug auf die Modellierung der Ischämie-Reperfusionsverletzung, Manipulationen der zellulären Umgebung, wie Hyperkaliämie, Azidose, und Laktatakkumulation, wurden eingeführt19. Andere Methoden sind Zellpelleting zur Behinderung der Sauerstoffdiffusion20 und metabolische Hemmung mit Zyanid21. Im aktuellen Protokoll wurde eine Zellverletzung durch eine relativ einfache Methode erreicht, nämlich 24 h Entzug von Sauerstoff und Nährstoffen. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, genaue pathophysiologische Prozesse der ischämischen Herzkrankheit zu berücksichtigen, da es in der Tat Unterschiede zwischen der Krankheit in vivo und dem Krankheitsmodell des aktuellen Protokolls gibt, wie das Vorhandensein oder Fehlen einer dreidimensionalen zellulären Umgebung und Blut.
In Bezug auf den technologischen Aspekt der Bewertung der Kardiomyozytenfunktion berichteten Toepfer et al. über einen MatLab-basierten Algorithmus zur Bestimmung der Sarkomekontraktion und Entspannung in hiPS-CMs22. Smith et al. berichteten über eine fortschrittliche Methode der elektrophysiologischen Analyse von erregbaren Zellen mit hohem Durchsatz, die von hiPS-CMs abgeleitet wurden, mit hochentwickelten nanotopographisch gemusterten Multielektroden-Arrays23,24. Der Vorteil unseres Protokolls ist, dass es nur herkömmliche Software und Verbrauchsmaterialien wie imageJ-Software und 96-Well-Platten benötigt.
In Bezug auf den Sauerstoffgehalt im Herzen wird angenommen, dass der Sauerstoffdruck in venen, die das Herz erreichen, 40 mmHg25beträgt. Nach McDougal et al. wird der extrazelluläre Sauerstoffdruck unter Hypoxie auf <12,8 mmHg26geschätzt. Bei Anwendung der Methode rounds et al.27wird der Sauerstoffdruck im Kulturmedium (Salzgehalt: 35 °) unter dem hypoxischen Zustand (2% Sauerstoff) bei 37 °C, der mit dem aktuellen Protokoll behandelt wird, auf 14,9 mmHg berechnet, was höher ist als die obige Schätzung. Interessanterweise berichteten Al-Ani et al., dass es einen Gradienten des Sauerstoffdrucks im Kulturmedium gibt und der Sauerstoffdruck durch Zelltyp, Sädichte und mittleres Volumen28beeinflusst wird. Typischerweise ist die Sauerstoffkonzentration an der Unterseite der Kulturplatte, in der sich zellenbefinden, am niedrigsten. Daher würde die Wirkung der Tiefe im Kulturmedium den effektiven Sauerstoffdruck in der Nähe von hiPS-CMs weiter reduzieren. Um ausreichende Schäden an HiPS-CMs mit hypoxischem Zustand zu induzieren, muss sorgfältig auf die Tiefe des Mediums und die Dichte der Zellen geachtet werden.
Unser hiPS-CM-Modell, das sehr nah an den physiologischen Bedingungen menschlicher Herzmyozyten liegt, imitiert vorteilhafterweise menschliche IHD. Tiermodellbasierte Ansätze umfassen ethische, technische und akademische Fragen. Insbesondere in vivo-Modelle erfordern eine fortschrittliche Technik der Mikrochirurgie, um reproduzierbare Daten zu erreichen: z.B. Okklusion des vorderen absteigenden Zweigs der linken Koronararterie bei Nagetieren3. Das hier beschriebene hiPS-CM-Modell überwindet diese kritischen Barrieren und bietet eine nützliche, relevante und wiederholbare Plattform für Herz-Kreislauf-Erkrankungen.
Es sollten jedoch einige Einschränkungen beachtet werden. Ein offensichtlicher Unterschied zwischen iPS-induzierten Kardiomyozyten und normalen Kardiomyozyten ist das Fehlen von T-Tubules29, und wir haben keine humoralen Faktoren wie Gewebeschäden, die durch Leukozyten induziert werden, und die Aktivierung eines Komplementsystems in unsere Studie aufgenommen. Darüber hinaus sollte die Rate der differenzierten Kardiomyozyten in diesem Modell (20,7 ± 9,6 %, Zusatzabbildung 3) verbessert werden. Die jüngste Veröffentlichung von Halloin et al. beschreibt eine skalierbare, chemisch definierte Methode, um hiPS-CM Reinheit von >95% durch chemische WNT-Signalwegmodulatoren zu induzieren, ohne dass eine Auswahl durch Marker30erforderlich ist. Dennoch ist unser Modell der menschlichen IHD relativ einfach und klinisch anwendbar (z. B. Arzneimittelscreening mit patientenabgeleiteten iPS-Zellen). Unser Modell ist auch eine einzigartige Plattform, um Mechanismen, die IHDs zugrunde liegen, weiter aufzuklären.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von JSPS KAKENHI, Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research), 17KK0168, unterstützt. Die Autoren danken central Research Laboratory, Okayama University Medical School für die Unterstützung von FACS.
Actin staining reagent (ActinRed 555 ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37112 | |
Anti cardiac troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MA5-12960 | |
Cardiomyocyte maintenance medium (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Cell dissociation enzymes (TrypLE Select) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12563011 | |
Differentiation medium A (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
Differentiation medium B (PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2921201 | |
FACS Aria III system | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | ||
Fluorescenct microscope | KEYENCE, Osaka, Japan | BZ-X710 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A28175 | |
Human iPS cells | RIKEN, Tsukuba, Japan | 201B7 | |
Hypoxic incubator | SANYO, Osaka, Japan | MCO-175M | |
iPSC growth medium (Essential 8 Medium) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A1517001 | |
iPSC maintenance medium (StemFit AK02N) | Ajinomoto, Tokyo, Japan | RCAK02N | |
Laminin (iMatrix-511) | Nippi, Tokyo, Japan | iMatrix-511 | |
MTT assay kit (MTT Cell Proliferation Assay Kit) | Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA | 10009365 | |
Nucleus staining reagent (NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | R37606 | |
Triton X-100 | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 35501-02 |