Host Aralığı ve Görsel Seçimi Kullanarak Rekombinant Poxviruses Hızlı, Sorunsuz Nesil
Summary
Bu konak aralığı seçimi ve rekombinant virüslerin görsel kimlik kullanarak “scarless” rekombinant vaccinia virüsler oluşturmak için bir yöntemdir.
Abstract
Vaccinia virüsü (VACV) variola virüsünün (VARV) kökünün kazınmasına yardımcı oldu. Vacv, aşı olarak ilk kullanımından bu yana terapötik aşılar için vektör ve onkolitik virüs olarak geliştirilmiştir. Bu uygulamalar, VACV’un kolayca manipüle edilen genomundan ve çeşitli terapötik uygulamalarla rekombinant virüsler oluşturmak için olağanüstü bir platform olarak geniş ana bilgisayar aralığından yararlanır. Marker seçimi yöntemleri ve geçici baskın seçki dahil olmak üzere rekombinant VACV oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada, rekombinant virüslerin görsel tanımlaması ile birleştiğinde bir ana dizi seçim yöntemi nin bir iyileştirmesi salıyoruz. Yöntemimiz, iki VACV PKR antagonistinden biri olan mCherry etiketli E3L’yi ifade eden floresan füzyon geni ile birleşen konak antiviral protein kiazaz R (PKR) tarafından oluşturulan seçici basınçtan yararlanır. Kaset, ilgi geni ve mCherry-E3L füzyon uvacv genomundan elde edilen diziler ile çevrilidir. İlgi geni ve mCherry-E3L arasında homolog rekombinasyon ve seçim den sonra mCherry-E3L geni kaybıteşvik etmek için, 3 ‘kol ilk ~ 150 nükleotitler aynı daha küçük bir bölgedir. Bu yöntemin, mutant virüsler için ilaç seçimi veya kapsamlı tarama gerektirmeden çeşitli hücre tiplerinde verimli ve sorunsuz rVACV üretimine izin verdiğini gösteriyoruz.
Introduction
Vaccinia virüsü (VACV) bir insan patojeni ilk başarılı eradikasyon için aracı oldu, variola virüsü (VARV), doğadan. Variola virüsünün yok edilmesinden bu yana, VACV dahil olmak üzere poxviruses hem insan hem de hayvan tıbbı için yararlı terapötik virüsler olmaya devam edilmiştir. Örneğin, bir VACV tabanlı kuduz virüsü aşısıAvrupa’da sylvatic kuduz bulaşmasını önlemede çok etkili olmuştur 1 ve Amerika Birleşik Devletleri2. Daha yakın zamanda, anti-tümör molekülleri çeşitli ifade rekombinant poxviruses (örneğin, tek zincirli antikorlar veya insan eritropoietin) onkolitik ajanlar olarak teşvik başarı gördük3,4,5. VACV genetik manipülasyon için kolayca münasip olduğu için bir vektör olarak özellikle çekici, geniş bir konak aralığına sahiptir, ve çeşitli koşullar altında istikrarlı, alanında kolay ulaşım ve aşı canlılığı sağlayan6,7. Laboratuvar deneyleri ve aşı üretimi için rekombinant VACV üretmek için birden fazla teknik geliştirilmiş olsa da, bu virüsleri üretmek için mevcut stratejiler önemli sınırlamalar vardır.
VACV’un yararı nedeniyle, rekombinant virüsler oluşturmak için birden fazla strateji geliştirilmiştir. İlk strateji, transgen ve antibiyotik direnç geni gibi seçilebilir marker geni içeren bir kaset tanıtmak için homolog rekombinasyon kullanır. Kaset iki ~ 500 nükleotit (nt) veya daha büyük kollar viral genom, daha sonra stably çift crossover olaylar8,9,10ile entegre belirli bir siteye gen yönlendiren çevrilidir. Bu strateji hızlı ve verimlidir; ancak, beklenmeyen etkilere neden olabilir marker geni şeklinde ekstra genetik malzeme ile sonuçlanır. Ayrıca, mevcut benzersiz seçilebilir belirteçlerin sayısı ile sınırlı olarak tanıtılabilir transgen lerin sayısı için pratik bir üst sınır vardır. Geçici baskın seçilim (TDS) stratejileri “scarless” rekombinant virüslerin oluşumunu kolaylaştırarak bu sorunu ele almış11. Bu strateji kullanılarak, mutant VACV geni ve seçilebilir marker geni içeren bir plazmid viral genoma entegre edilmiştir, ancak vacv DNA’sını ekleyen bir kanaat olmadan. Bu yaklaşım, tek bir crossover olayı ile bütünleşme sonucunda VACV geninin tamamının geçici entegrasyonu ve çoğaltılması ile sonuçlanır. Bu ara, seçim baskısı altında muhafaza edildiği sürece stabildir ve bu yapının zenginleşmesine izin verilir. Seçim kaldırıldığında, VACV çoğaltma yaklaşık 50:50 oranında yabani tip (wt) veya rekombinant virüsün plazmid ve sonraki oluşumunun kaldırılması ile sonuçlanan ikinci bir crossover olay sağlar. TDS yabancı DNA’nın istikrarlı bir şekilde piyasaya sürülmesini gerektirmeden rekombinant virüsler üretirken, birden fazla virüs klonu, potansiyel olarak zaman alıcı ve maliyetli bir adım olan dizianalizi ile beklenen mutasyon için taranmalıdır.
Burada, bu yaklaşımların her birinin en iyi yönlerini birleştiren rekombinant poxviruses üreten bir yaklaşım savuruyoruz, replikasyon yetersiz modifiye vaccinia Ankara12için açıklanan bir yaklaşım a benzer12 ,13,14. Bu strateji, çift crossover olaylarla hızla rekombinant virüsler oluşturmak ve daha sonra homolog rekombinasyon ile seçilebilir marker genini ortadan kaldırmak için görsel ve ana bilgisayar aralığı seçimini birleştirir. Bu yaklaşım, homolog rekombinasyon aracılığı ile mutantların hızlı nesil izin verir, TDS yaklaşımlarının “scarless” doğası ile, vahşi tip ve mutant virüsleri ayırt etmek için bir sonraki tarama adımı gerektirmez iken. Yöntemimiz aynı zamanda antibiyotik seçimi yerine konak aralığı seçimi kullanır, hücre hattında kimyasal olarak indüklenen phenotik değişiklikler riskini ortadan kaldırarak. Bu yaklaşım için, rekombinant VACV oluşturmak için selektif ajan olarak konak antiviral protein kiril R (PKR) kullanmayı seçtik. PKR çoğu hücre türünde etkin olmayan bir monomer olarak ifade edilir15. N-terminal dsRNA bağlayıcı etki alanlarında çift iplikli RNA (dsRNA) bağlanan üzerine, PKR dimerizes ve otofosforile16. PKR fosforilatbu aktif formu ökaryotik inisiyasyon faktörü 2 (eIF2) alfa alt birimi, sonuçta ribozom için başlatıcı metiyonil-tRNA teslim inhibe, böylece hücre içi çeviri önlenmesi ve geniş birçok virüs ailelerinin çoğaltılmasını inhibe17,18.
PKR geniş ve güçlü antiviral aktiviteyanıt olarak, birçok virüs PKR aktivasyonu önlemek için en az bir strateji gelişti. Çoğu poxviruses iki PKR antagonistleri ifade, VACV E3L ve K3L genleri tarafından kodlanmış, hangi iki farklı mekanizmalar aracılığıyla PKR antagonize19. E3 çift iplikli RNA20bağlayarak PKR homodimerization önler,21, K3 doğrudan aktive PKR bağlanarak bir psödosubstrat inhibitörü olarak hareket ederken ve bu nedenle substrat eIF2α22ile etkileşimi inhibe . Daha da önemlisi, bu iki PKR antagonisti tüm türlerden PKR’yi mutlaka engellemez. Örneğin, koyun çiçeği virüsüK 3 homolog kuvvetle koyun PKR inhibe ederken, koyun E3 homolog önemli PKR inhibisyonu23,,24. Bu çalışmada, e3L ve K3L (VC-R4) için silinen bir VACV rekombinant oluşturmak için floresan seçimi ile birlikte PKR aracılı selektif basınç kullanmak için bir yöntem sürünüldü, hangi PKR yetkili hücrelerde farklı türlerden elde edilen çoğalamaz. Bu rekombinant virüs yerli E3L organizatörü kontrolü altında genleri ifade rekombinant virüslerin hızlı nesil için mükemmel bir arka plan sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada son rekombinant virüs yabancı DNA tutmadan rekombinant vaccinia virüsleri oluşturmak için geçici bir marker seçim stratejisi 32 bir varyasyonu sıyoruz. Stratejimiz, antibiyotikler gibi diğer seçici basınç biçimleri yerine ev sahibi antiviral protein PKR aracılığındaki seçici basıncı kullanır. Konak antiviral genlerin kullanımı hücrelerde kimyasal kaynaklı fenotipik değişiklikler olasılığını ortadan kaldırır, ya da seçim ilaçları nedeniyle mutasyon riskin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI114851) tarafından SR’ye finanse edilmiştir.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
