Generazione rapida e senza soluzione di continuità di poxvirus ricombinanti utilizzando la gamma host e la selezione visiva
Summary
Questo è un metodo per generare virus vaccinia ricombinanti “senza cicatrici” utilizzando la selezione host-range e l’identificazione visiva dei virus ricombinanti.
Abstract
Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per eradicare il virus variola (VARV), l’agente causale del vaiolo, dalla natura. Dal suo primo utilizzo come vaccino, VACV è stato sviluppato come vettore per i vaccini terapeutici e come virus oncolitico. Queste applicazioni sfruttano il genoma facilmente manipolabile di VACV e l’ampia gamma di host come una piattaforma eccezionale per generare virus ricombinanti con una varietà di applicazioni terapeutiche. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare VACV ricombinante, tra cui metodi di selezione dei marcatori e selezione dominante transitoria. Qui, presentiamo un perfezionamento di un metodo di selezione dell’intervallo host accoppiato con l’identificazione visiva dei virus ricombinanti. Il nostro metodo sfrutta la pressione selettiva generata dalla proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) accoppiata con un gene di fusione fluorescente che esprime E3L con tag mCherry, uno dei due antagonisti VACV PKR. La cassetta, compreso il gene di interesse e la fusione mCherry-E3L, è affiancata da sequenze derivate dal genoma VACV. Tra il gene di interesse e mCherry-E3L c’è una regione più piccola che è identica ai primi 150 nucleotidi del braccio da 3′, per promuovere la ricombinazione omologa e la perdita del gene mCherry-E3L dopo la selezione. Dimostriamo che questo metodo consente una generazione efficiente e senza soluzione di continuità di rVACV in una varietà di tipi di cellule senza richiedere la selezione di farmaci o uno screening completo per i virus mutanti.
Introduction
Il virus Vaccinia (VACV) è stato determinante per la prima eradicazione di successo di un patogeno umano, il virus variola (VARV), dalla natura. Fin dallo sterminio del virus della variola, i poxvirus tra cui VACV hanno continuato ad essere utili virus terapeutici sia per la medicina umana che per quella animale. Ad esempio, un vaccino contro il virus della rabbia basato su VACV è stato molto efficace nel prevenire la trasmissione della rabbia silvatica in Europa1 e negli Stati Uniti2. Più recentemente, i poxvirus ricombinanti che esprimono una varietà di molecole antitumorali (ad esempio, anticorpi a catena singola o eritropoietina umana) hanno visto un successo incoraggiante come agenti oncolitici3,4,5. VACV è particolarmente attraente come vettore perché è facilmente suscettibile di manipolazione genetica, possiede una vasta gamma di ospiti, ed è stabile in una varietà di condizioni, consentendo un facile trasporto e la vitalità del vaccino nel campo6,7. Mentre sono state sviluppate diverse tecniche per generare VACV ricombinante per esperimenti di laboratorio e generazione di vaccini, le attuali strategie per generare questi virus hanno notevoli limitazioni.
Grazie all’utilità di VACV, sono state sviluppate più strategie per generare virus ricombinanti. La prima strategia utilizza una ricombinazione omologa per introdurre una cassetta che include il transgene e un gene marcatore selezionabile come un gene di resistenza agli antibiotici. La cassetta è affiancata da due nucleotidi da 500 dollari (nt) o bracci più grandi che indirizzano il gene verso un sito specifico del genoma virale, che viene poi stabilmente integrato da eventi crossover doppi8,9,10. Questa strategia è rapida ed efficiente; tuttavia, si traduce in materiale genetico extra sotto forma di gene marcatore che può produrre effetti imprevisti. Inoltre, esiste un limite massimo pratico al numero di transgeni che possono essere introdotti limitata dal numero di marcatori unici selezionabili disponibili. Le strategie di selezione dominante transitoria (TDS) hanno affrontato questo problema facilitando la generazione di virus ricombinanti “senza cicatrici”11. Utilizzando questa strategia, un plasmide contenente un gene MUTANTe VACV e un gene marcatore selezionabile sono integrati nel genoma virale, ma senza ulteriore fianco DNA VACV affiancato. Questo approccio si traduce nell’integrazione transitoria dell’intero plasmide e nella duplicazione del gene VACV come risultato dell’integrazione da parte di un singolo evento di crossover. Questo intermedio è stabile finché viene mantenuto sotto pressione di selezione, permettendo l’arricchimento di questo costrutto. Quando la selezione viene rimossa, la duplicazione VACV consente un secondo evento di crossover che comporta la rimozione del plasmide e la successiva formazione del virus di tipo selvaggio (wt) o ricombinante in un rapporto approssimativo di 50:50. Mentre tDS genera virus ricombinanti senza richiedere l’introduzione stabile del DNA estraneo, più cloni di virus devono essere sottoposti a screening per la mutazione prevista mediante l’analisi del sequenziamento, un passo potenzialmente dispendioso in termini di tempo e denaro.
Qui, presentiamo un approccio alla generazione di poxvirus ricombinanti che combinano i migliori aspetti di ciascuno di questi approcci, simile a un approccio che è stato descritto per la replica incompetente modificato vaccini Ankara12,13,14. Questa strategia combina la selezione della gamma visiva e dell’ospite per generare rapidamente virus ricombinanti mediante eventi di crossover doppi e successivamente elimina il gene marcatore selezionabile mediante la ricombinazione omologa. Questo approccio consente la rapida generazione di mutanti mediati dalla ricombinazione omologa, con la natura “senza cicatrici” degli approcci TDS, pur non richiedendo una successiva fase di screening per distinguere il tipo selvaggio e i virus mutanti. Il nostro metodo utilizza anche la selezione della gamma host al posto della selezione degli antibiotici, eliminando il rischio di cambiamenti fenotipici chimicamente indotti nella linea cellulare. Per questo approccio, abbiamo scelto di utilizzare la proteina antivirale ospite chinasi R (PKR) come agente selettivo per generare VACV ricombinante. PKR è espresso come un monomero inattivo nella maggior parte dei tipi di cella15. Quando si lega l’RNA a doppio filamento (dsRNA) nei domini di legame dsRNA del terminale N, pKR si dimerde e viene autofosforelofillato16. Questa forma attiva di fosforolato PKR la sottounità alfa del fattore di avvio eucariotico 2 (eIF2), inibendo infine la consegna di frattempo meticonil-tRNA al ribosoma, impedendo così la traduzione intracellulare e inibendo ampiamente la replicazione di molte famiglie virus17,18.
In risposta all’ampia e potente attività antivirale del PKR, molti virus hanno sviluppato almeno una strategia per prevenire l’attivazione del PKR. La maggior parte dei poxvirus esprime due antagonisti del PKR, codificati dai geni E3L e K3L in VACV, che antagonizzano il PKR attraverso due meccanismi distinti19. E3 previene l’omodimerizzazione del PKR legando l’RNA a doppio filamento20,21, mentre K3 agisce come un inibitore pseudosubstrate legandosi direttamente al PKR attivato e quindi inibendo l’interazione con il suo substrato eIF2 .22 È importante sottolineare che questi due antagonisti del PKR non inibiscono necessariamente il PKR a tutte le specie. Ad esempio, l’omolologo K3 del virus del vaiolo delle pecore inibiva fortemente il PKR dalle pecore, mentre il pologio di pecora E3 non mostrava una notevole inibizione del PKR23,24. In questo studio, presentiamo un metodo per utilizzare la pressione selettiva mediata da PKR combinata con la selezione della fluorescenza per generare un ricombinante VACV eliminato per E3L e K3L (VC-R4), che non può replicare in cellule competenti pKR derivate da specie diverse. Questo virus ricombinante fornisce un eccellente background per la generazione rapida di virus ricombinanti che esprimono geni sotto il controllo del promotore nativo E3L.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui presentiamo una variazione di una strategia di selezione dei marcatori transitoria 32 per generare virus della vaccino ricombinante senza trattenere il DNA estraneo nel virus ricombinante finale. La nostra strategia utilizza una pressione selettiva mediata dalla proteina antivirale ospite PKR piuttosto che da altre forme di pressione selettiva come gli antibiotici. L’uso di geni antivirali ospiti elimina la possibilità di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente nelle cellule o un aumento …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health (AI114851) a SR.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
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