Generación rápida y sin fisuras de poxvirus recombinantes utilizando el rango de host y la selección visual
Summary
Este es un método para generar virus de vacuna recombinante “sin cicatrices” utilizando la selección del rango de host y la identificación visual de virus recombinantes.
Abstract
El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental en la erradicación del virus de la variola (VARV), el agente causante de la viruela, de la naturaleza. Desde su primer uso como vacuna, vacv se ha desarrollado como vector para vacunas terapéuticas y como virus oncolítico. Estas aplicaciones aprovechan el genoma fácilmente manipulado de VACV y la amplia gama de hosts como una plataforma excepcional para generar virus recombinantes con una variedad de aplicaciones terapéuticas. Se han desarrollado varios métodos para generar VACV recombinante, incluyendo métodos de selección de marcadores y selección dominante transitoria. Aquí, presentamos un refinamiento de un método de selección de rango de host junto con la identificación visual de virus recombinantes. Nuestro método aprovecha la presión selectiva generada por la proteína quinasa antiviral huésped R (PKR) junto con un gen de fusión fluorescente que expresa mCherry con la etiqueta E3L, uno de los dos antagonistas de PKR VACV. El casete, incluyendo el gen de interés y la fusión mCherry-E3L está flanqueado por secuencias derivadas del genoma VACV. Entre el gen de interés y mCherry-E3L hay una región más pequeña que es idéntica a los primeros 150 nucleótidos del brazo de 3′, para promover la recombinación homóloga y la pérdida del gen mCherry-E3L después de la selección. Demostramos que este método permite una generación eficiente y sin problemas de rVACV en una variedad de tipos de células sin necesidad de selección de fármacos o cribado extensivo de virus mutantes.
Introduction
El virus de la vacuna (VACV) fue fundamental para la primera erradicación exitosa de un patógeno humano, el virus de la variola (VARV), de la naturaleza. Desde el exterminio del virus de la variola, los poxvirus, incluido el VVAC, han seguido siendo virus terapéuticos útiles tanto para la medicina humana como para la medicina animal. Por ejemplo, una vacuna contra el virus de la rabia basada en VCVa ha sido muy eficaz para prevenir la transmisión de la rabia silvática en Europa1 y los Estados Unidos2. Más recientemente, los poxvirus recombinantes que expresan una variedad de moléculas antitumorales (por ejemplo, anticuerpos de cadena única o eritropoyetina humana) han visto un éxito alentador como agentes oncolíticos3,4,5. VACV es particularmente atractivo como vector porque es fácilmente susceptible a la manipulación genética, posee una amplia gama de huéspedes, y es estable en una variedad de condiciones, lo que permite un fácil transporte y viabilidad de la vacuna en el campo6,7. Si bien se han desarrollado múltiples técnicas para generar VACV recombinante para experimentos de laboratorio y generación de vacunas, las estrategias actuales para generar estos virus tienen limitaciones notables.
Debido a la utilidad de VACV, se han desarrollado múltiples estrategias para generar virus recombinantes. La primera estrategia emplea una recombinación homóloga para introducir un casete que incluya el transgén y un gen marcador seleccionable, como un gen de resistencia a los antibióticos. El cassette está flanqueado por dos nucleótidos de 500 o más grandes que dirigen el gen a un sitio específico en el genoma viral, que luego se integra de forma estable por eventos de doble cruce8,9,10. Esta estrategia es rápida y eficiente; sin embargo, resulta en material genético extra en forma del gen marcador que puede producir efectos inesperados. Además, hay un límite superior práctico para el número de transgenes que se pueden introducir limitados por el número de marcadores seleccionables únicos disponibles. Las estrategias de selección dominante transitoria (TDS) han abordado esta cuestión facilitando la generación de virus recombinantes “sin cicatrices”11. Usando esta estrategia, un plásmido que contiene un gen VAV mutante y un gen marcador seleccionable se integran en el genoma viral, pero sin ADN VAV de flanqueo adicional. Este enfoque da como resultado la integración transitoria de todo el plásmido y la duplicación del gen VACV como resultado de la integración por un solo evento cruzado. Este intermedio es estable siempre y cuando se mantenga bajo presión de selección, permitiendo el enriquecimiento de esta construcción. Cuando se elimina la selección, la duplicación vacv permite un segundo evento de cruce que da como resultado la eliminación del plásmido y la posterior formación del tipo salvaje (wt) o del virus recombinante en una proporción aproximada de 50:50. Mientras que tDS genera virus recombinantes sin requerir la introducción estable de ADN extraño, múltiples clones de virus deben ser examinados para detectar la mutación esperada mediante análisis de secuenciación, un paso potencialmente lento y costoso.
Aquí, presentamos un enfoque para generar poxvirus recombinantes combinando los mejores aspectos de cada uno de estos enfoques, similar a un enfoque que se ha descrito para la replicación incompetente modificada vaccinia Ankara12,13,14. Esta estrategia combina la selección de rango visual y de host para generar rápidamente virus recombinantes mediante eventos cruzados dobles, y posteriormente eliminar el gen marcador seleccionable mediante recombinación homóloga. Este enfoque permite la rápida generación de mutantes mediados por la recombinación homóloga, con la naturaleza “sin cicatrices” de los enfoques TDS, sin necesidad de un paso de detección posterior para distinguir el tipo salvaje y los virus mutantes. Nuestro método también utiliza la selección de rango de huésped en lugar de la selección de antibióticos, eliminando el riesgo de cambios fenotípicos inducidos químicamente en la línea celular. Para este enfoque, hemos optado por utilizar la proteína quinasa antiviral huésped R (PKR) como agente selectivo para generar VACV recombinante. PKR se expresa como un monómero inactivo en la mayoría de los tipos de células15. Al enlazar el ARN de doble cadena (dsRNA) en los dominios de enlace dsRNA N-terminal, PKR dimerizes y se autofosforilated16. Esta forma activa de PKR fosforila la subunidad alfa del factor de iniciación eucariota 2 (eIF2), inhibiendo en última instancia la entrega de metaonil-tRNA de iniciador al ribosoma, evitando así la traducción intracelular e inhibiendo ampliamente la replicación de muchas familias de virus17,,18.
En respuesta a la amplia y potente actividad antiviral de PKR, muchos virus han desarrollado al menos una estrategia para prevenir la activación de PKR. La mayoría de los poxvirus expresan dos antagonistas de PKR, codificados por los genes E3L y K3L en VACV, que antagonizan PKR a través de dos mecanismos distintos19. E3 previene la homodimerización pkR mediante la unión de ARN de doble cadena20,21, mientras que K3 actúa como un inhibidor de pseudosustrato mediante la unión directa a PKR activado y, por lo tanto, la inhibición de la interacción con su sustrato eIF222. Es importante destacar que estos dos antagonistas de PKR no inhiben necesariamente pkR de todas las especies. Por ejemplo, el homólogo K3 del virus de la viruela ovina inhibió fuertemente la PKR de las ovejas, mientras que el homólogo e3 de la viruela ovina no mostró una inhibición considerable de PKR23,24. En este estudio, presentamos un método para utilizar la presión selectiva mediada por PKR combinada con la selección de fluorescencia para generar un VACV recombinante eliminado para E3L y K3L (VC-R4), que no puede replicarse en células competentes PKR derivadas de diversas especies. Este virus recombinante proporciona un excelente trasfondo para la rápida generación de virus recombinantes que expresan genes bajo el control del promotor nativo de E3L.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí presentamos una variación de una estrategia de selección de marcadores transitorios 32 para generar virus de vacuna recombinante sin retener ADN extraño en el virus recombinante final. Nuestra estrategia utiliza presión selectiva mediada por la proteína antiviral huésped PKR en lugar de otras formas de presión selectiva como los antibióticos. El uso de genes antivirales de huésped elimina la posibilidad de cambios fenotípicos inducidos químicamente en las células, o un mayor ries…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (AI114851) a SR.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
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