Schnelle, nahtlose Generierung von rekombinanten Poxviren mit Host Range und visueller Auswahl
Summary
Dies ist eine Methode, um “scarinant” rekombinante Vaknie-Viren mit Host-Range-Auswahl und visuelle Identifizierung von rekombinanten Viren zu generieren.
Abstract
Das Vaccinia-Virus (VACV) war maßgeblich an der Ausrottung des Variolavirus (VARV), des Erregers der Pocken, aus der Natur beteiligt. Seit seiner ersten Verwendung als Impfstoff wurde VACV als Vektor für therapeutische Impfstoffe und als onkolytisches Virus entwickelt. Diese Anwendungen nutzen das leicht zu manipulierende Genom und das breite Host-Sortiment von VACV als hervorragende Plattform, um rekombinante Viren mit einer Vielzahl von therapeutischen Anwendungen zu erzeugen. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um rekombinante VACV zu erzeugen, einschließlich Markerauswahlmethoden und transient dominante Selektion. Hier stellen wir eine Verfeinerung einer Hostrange-Auswahlmethode in Verbindung mit der visuellen Identifizierung rekombinanter Viren vor. Unsere Methode nutzt den selektiven Druck, der von der antiviralen Proteinkinase R (PKR) des Wirts erzeugt wird, gekoppelt mit einem fluoreszierenden Fusionsgen, das mCherry-tagged E3L, einen von zwei VACV PKR-Antagonisten, exzessiiert. Die Kassette, einschließlich des Gens von Interesse und der mCherry-E3L Fusion, wird von Sequenzen flankiert, die aus dem VACV-Genom abgeleitet sind. Zwischen dem Gen von Interesse und mCherry-E3L ist eine kleinere Region, die identisch mit den ersten 150 Nukleotiden des 3′ Arms ist, um homologe Rekombination und Verlust des mCherry-E3L-Gens nach der Selektion zu fördern. Wir zeigen, dass diese Methode eine effiziente, nahtlose Erzeugung von rVACV in einer Vielzahl von Zelltypen ermöglicht, ohne dass eine Arzneimittelauswahl oder ein umfangreiches Screening auf mutierte Viren erforderlich ist.
Introduction
Das Vaccinia-Virus (VACV) war entscheidend für die erste erfolgreiche Tilgung eines menschlichen Erregers, des Variolavirus (VARV), aus der Natur. Seit der Ausrottung des Variola-Virus sind Poxviren einschließlich VACV weiterhin nützliche therapeutische Viren für die Human- und Tiermedizin. Beispielsweise hat ein VACV-basierter Tollwutvirus-Impfstoff die Übertragung von sylvatischer Tollwut in Europa1 und den Vereinigten Staaten sehr wirksam verhindert2. In jüngerer Zeit haben rekombinante Poxviren, die eine Vielzahl von Anti-Tumor-Molekülen (z. B. einkettige Antikörper oder menschliches Erythropoietin) exzieren, ermutigende Erfolge als onkolytische Wirkstoffegesehen 3,4,5. VACV ist als Vektor besonders attraktiv, da es leicht für genetische Manipulationen geeignet ist, ein breites Wirtsspektrum besitzt und unter einer Vielzahl von Bedingungen stabil ist, was einen einfachen Transport und eine mögliche Lebensfähigkeit des Impfstoffs im Feld6,7ermöglicht. Während mehrere Techniken entwickelt wurden, um rekombinante VACV für Laborexperimente und Impfstoffgenerierung zu erzeugen, haben aktuelle Strategien zur Generierung dieser Viren bemerkenswerte Einschränkungen.
Aufgrund des Nutzens von VACV wurden mehrere Strategien zur Erzeugung rekombinanter Viren entwickelt. Die erste Strategie verwendet homologe Rekombination, um eine Kassette mit dem Transgen und einem wählbaren Markergen wie einem Antibiotikaresistenzgen einzuführen. Die Kassette wird flankiert von zwei Nukleotiden (nt) oder größeren Armen, die das Gen an einen bestimmten Ort im viralen Genom leiten, der dann stabil durch Doppel-Crossover-Ereignisse8,9,10integriert wird. Diese Strategie ist schnell und effizient; Es führt jedoch zu zusätzlichem genetischem Material in Form des Markergens, das unerwartete Effekte hervorrufen kann. Darüber hinaus gibt es eine praktische Obergrenze für die Anzahl der Transgene, die durch die Anzahl der verfügbaren eindeutigen wählbaren Marker begrenzt eingeführt werden können. Transient dominante Selektionsstrategien (TDS) haben dieses Problem angegangen, indem sie die Erzeugung von “scarless” rekombinanten Viren erleichtert haben11. Mit dieser Strategie werden ein Plasmid, das ein mutiertes VACV-Gen und ein wählbares Markergen enthält, in das virale Genom integriert, jedoch ohne zusätzliche flankierende VACV-DNA. Dieser Ansatz führt zu einer transienten Integration des gesamten Plasmids und zur Duplizierung des VACV-Gens als Folge der Integration durch ein einziges Crossover-Ereignis. Dieses Zwischenprodukt ist stabil, solange es unter Selektionsdruck aufrechterhalten wird, was eine Anreicherung dieses Konstrukts ermöglicht. Wenn die Auswahl entfernt wird, ermöglicht die VACV-Duplikation ein zweites Crossover-Ereignis, das zur Entfernung des Plasmids und der anschließenden Bildung des Wildtyps (Wt) oder des rekombinanten Virus im Verhältnis von ungefähr 50:50 führt. Während TDS rekombinante Viren erzeugt, ohne dass die stämmige Einführung fremder DNA erforderlich ist, müssen mehrere Virusklone durch Sequenzierungsanalyse auf die erwartete Mutation untersucht werden, ein potenziell zeitaufwändiger und kostspieliger Schritt.
Hier stellen wir einen Ansatz zur Erzeugung rekombinanter Poxviren vor, der die besten Aspekte jedes dieser Ansätze kombiniert, ähnlich einem Ansatz, der für die Replikation inkompetent modifizierte Impfung Ankara12,13,14beschrieben wurde. Diese Strategie kombiniert visuelle und Host-Bereichs-Auswahl, um schnell rekombinante Viren durch Doppel-Crossover-Ereignisse zu erzeugen, und anschließend das wählbare Markergen durch homologe Rekombination zu beseitigen. Dieser Ansatz ermöglicht die schnelle Generierung von Mutanten, die durch homologe Rekombination vermittelt werden, mit der “scarless” Natur von TDS-Ansätzen, ohne einen nachfolgenden Screening-Schritt zu erfordern, um Wildtyp- und mutierte Viren zu unterscheiden. Unsere Methode verwendet auch die Auswahl des Wirtsbereichs anstelle der Antibiotikaauswahl, wodurch das Risiko chemisch induzierter phänotypischer Veränderungen in der Zelllinie eliminiert wird. Für diesen Ansatz haben wir uns entschieden, den Wirt antivirale Proteinkinase R (PKR) als selektives Mittel zur Erzeugung rekombinanter VACV zu verwenden. PKR wird in den meisten Zelltypen als inaktives Monomer ausgedrückt15. Bei Bindung von doppelsträngiger RNA (dsRNA) an den N-terminalen dsRNA-bindenden Domänen dimerisiert PKR und wird16autophosphoryliert. Diese aktive Form von PKR phosphoryliert die Alpha-Untereinheit des eukaryotischen Initiationsfaktors 2 (eIF2), was letztlich die Abgabe von Initiator Methionyl-tRNA an das Ribosom hemmt, wodurch die intrazelluläre Translation verhindert und die Replikation vieler Virusfamilien weitgehend hemmt17,18.
Als Reaktion auf die breite und starke antivirale Aktivität von PKR haben viele Viren mindestens eine Strategie entwickelt, um die PKR-Aktivierung zu verhindern. Die meisten Poxviren exprimieren zwei PKR-Antagonisten, die von den E3L- und K3L-Genen in VACV kodiert werden und PKR durch zwei unterschiedliche Mechanismen antagonisieren19. E3 verhindert die PKR-Homodimerisierung durch Bindung doppelsträngiger RNA20,21, während K3 als Pseudosubstratinhibitor wirkt, indem es direkt an aktivierte PKR bindet und dadurch die Wechselwirkung mit seinem Substrat eIF2-22hemmt. Wichtig ist, dass diese beiden PKR-Antagonisten PKR nicht unbedingt von allen Arten hemmen. Zum Beispiel hemmte der K3-Homolog des Schafpockenvirus PKR stark von Schafen, während der Schafpocken-E3-Homolog keine nennenswerte PKR-Hemmung zeigte23,24. In dieser Studie stellen wir eine Methode zur Verwendung von PKR-vermitteltem selektiven Druck in Kombination mit Fluoreszenzauswahl vor, um ein VACV-Rekombinant zu erzeugen, das für E3L und K3L (VC-R4) gelöscht wurde und sich in PKR-fähigen Zellen, die von verschiedenen Arten stammen, nicht replizieren kann. Dieses rekombinante Virus bietet einen ausgezeichneten Hintergrund für die schnelle Generierung rekombinanter Viren, die Gene unter Kontrolle des nativen E3L-Promotors exezieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine Variation einer transienten Markerauswahlstrategie 32 vor, um rekombinante Impfstoffviren zu erzeugen, ohne fremde DNA im endgültigen rekombinanten Virus zu speichern. Unsere Strategie verwendet selektiven Druck, der vom antiviralen Protein PKR des Wirts vermittelt wird, anstatt andere Formen des selektiven Drucks wie Antibiotika. Die Verwendung von antiviralen Wirtsgenen eliminiert die Möglichkeit chemisch induzierter phäkotypischer Veränderungen in den Zellen oder ein e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Projekt wurde von den National Institutes of Health (AI114851) an SR finanziert.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
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