דור מהיר, ללא תפר של רקומביננטי Poxviruses באמצעות טווח מארח ובחירה חזותית
Summary
זוהי שיטה להפקת וירוסים “להוריד” רקומביננטי vaccinia באמצעות בחירה בטווח המארח וזיהוי חזותי של רקומביננטי וירוסים.
Abstract
Vaccinia וירוס (VACV) היה אינסטרומנטלי וירוס בריאולה (VARV), הסוכן סיבתי של אבעבועות שחורות, מן הטבע. מאז השימוש הראשון שלה כחיסון, VACV פותחה כווקטור עבור חיסונים טיפוליים כמו וירוס oncolytic. יישומים אלה מנצלים את הגנום של VACV בקלות מניפולציה וטווח מארח רחב כפלטפורמה מצטיינים לייצר וירוסים רקומביננטי עם מגוון רחב של יישומים טיפוליים. מספר שיטות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV, כולל סמן שיטות בחירה שולטת ארעי. כאן, אנו מציגים עידון של שיטת בחירת טווח מארח ביחד עם זיהוי חזותי של וירוסים רקומביננטי. השיטה שלנו מנצלת לחץ סלקטיבי שנוצר על ידי מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) בשילוב עם גן היתוך פלורסנט ביטוי mCherry-tagged E3L, אחד משני היריבים VACV PKR. הקלטת, כולל הגן של הריבית ואת הפיוז mCherry-E3L מוקף רצפים נגזר הגנום VACV. בין הגן של הריבית ו-mCherry-E3L הוא אזור קטן יותר זהה הראשון ~ 150 נוקלאוטידים של 3 ‘ זרוע, כדי לקדם הומוולוגי מחדש ואובדן של הגן mCherry-E3L לאחר בחירה. אנו מדגימים כי שיטה זו מאפשרת דור יעיל, חלקה של rVACV במגוון סוגי תאים מבלי לדרוש בחירת סמים או הקרנה נרחבת עבור וירוסים מוטציה.
Introduction
Vaccinia וירוס (vacv) היה אינסטרומנטלי החיסול המוצלח הראשון של פתוגן אנושי, וירוס אבעבועות (varv), מן הטבע. מאז ההשמדה של וירוס אבעבועות, poxviruses כולל vacv המשיכו להיות שימושי וירוסים טיפולית עבור תרופות לבני אדם ובעלי חיים. לדוגמה, חיסון וירוס כלבת מבוסס VACV היה יעיל מאוד במניעת שידור של כלבת sylvatic באירופה1 ואת ארצות הברית2. לאחרונה, רקומביננטי poxviruses ביטוי מגוון של מולקולות נגד הגידול (g., שרשרת יחיד נוגדנים או אריתרופויאטין האדם) ראו לעודד הצלחה כסוכני oncolytic3,4,5. Vacv הוא אטרקטיבי במיוחד כמו וקטור כי זה קל מאוד מניפולציה גנטית, בעל טווח מארח רחב, והוא יציב תחת מגוון של תנאים, המאפשר הובלה קלה וכדאיות החיסון בשדה6,7. בעוד טכניקות מרובות פותחו כדי ליצור רקומביננטי VACV עבור ניסויים במעבדה הדור חיסון, אסטרטגיות נוכחיות להפקת וירוסים אלה יש מגבלות הבולטים.
בגלל השירות של VACV, אסטרטגיות מרובות כדי ליצור וירוסים רקומביננטי פותחו. האסטרטגיה הראשונה מעסיקה מחדש הומולוגי להציג קלטת כולל את הטרנסגנים ואת גן סמן לבחירה כגון גן עמידות לאנטיביוטיקה. הקלטת מוקף על ידי שני ~ 500 נוקלאוטידים (nt) או זרועות גדולות יותר הנחיית הגן לאתר מסוים בגנום ויראלי, אשר משולבים אז באופן מיוחד על ידי אירועים מוצלב כפול8,9,10. אסטרטגיה זו היא מהירה ויעילה; עם זאת, זה התוצאה חומר גנטי נוסף בצורה של הגן סמן שעשוי לייצר אפקטים בלתי צפויים. יתר על כן, יש מגבלה עליונה מעשית מספר הטרנסגנים שניתן להציג מוגבל על ידי מספר סמנים ייחודיים לבחירה זמין. אסטרטגיות בחירה שולטת (TDS) זמניות התייחסו לבעיה זו על ידי הקלה על הדור של “להוריד” רקומביננטי וירוסים11. באמצעות אסטרטגיה זו, פלסטלינה המכיל גן VACV מוטציה ו גן סמן לבחירה משולבים הגנום הנגיפי, אך ללא תוספת של ה-DNA VACV האגף. גישה זו מהווה שילוב ארעי של הפלסטיות כולו והשכפול של הגן VACV כתוצאה של שילוב של אירוע מוצלב אחד. ביניים זו יציבה כל עוד היא נשמרת תחת לחץ בחירה, תוך התרת העשרת המבנה. כאשר הבחירה מוסרת, שכפול VACV מאפשר אירוע מוצלב השני שתוצאתו הסרת הפלסמיד והיווצרות הבאים של סוג פראי (wt) או רקומביננטי וירוס ביחס 50:50 משוער. בעוד TDS מייצרת וירוסים רקומביננטי ללא צורך הקדמה יציבה של DNA זר, שיבוטים וירוסים מרובים חייב להיות מוקרן עבור מוטציה צפויה על ידי ניתוח רצף, שלב פוטנציאלי ארוך ויקר.
כאן, אנו מציגים גישה ליצירת רקומביננטי poxviruses המשלב את ההיבטים הטובים ביותר של כל אחת מגישות אלה, בדומה לגישה שתוארה עבור השכפול שונה vaccinia אנקרה12,13,14. אסטרטגיה זו משלבת טווח חזותי ומארח בחירה כדי ליצור במהירות רקומביננטי וירוסים על-ידי מוצלב אירועים כפולים, ולאחר מכן לחסל את הגן סמן לבחירה על ידי שילוב מחדש של הומוולוגי. גישה זו מאפשרת את הדור המהיר של מוטציות מתווכת על ידי שילוב הומוולוגי, עם הטבע “ללא צלקות” של גישות TDS, בעוד שאינו דורש צעד ההקרנה הבאים כדי להבחין סוג פראי ווירוסים מוטציה. השיטה שלנו גם משתמשת בבחירת טווח המארח במקום של בחירה אנטיביוטית, ביטול הסיכון של שינויי פנופאיות המושרה כימית בקו התא. עבור גישה זו, בחרנו להשתמש מארח אנטי חלבון קינאז R (PKR) כמו סוכן סלקטיבי כדי ליצור רקומביננטי VACV. PKR מבוטא כמונומר לא פעיל ברוב סוגי התאים15. באמצעות כריכה כפולה של רנ א (dsRNA) ב-N-terminal dsRNA-מתחם הכריכה, PKR והוא בתצוגה מקדימה של16. זו צורה פעילה של pkr זרחנית אלפא יחידת המשנה של הגורם החניכה איקריוטית 2 (eIF2), בסופו של דבר עיכוב מסירת מתיונין היוזם-trna ל ריבוחלק, ובכך מניעת תרגום תאיים ומעכב באופן נרחב את השכפול של משפחות וירוסים רבים17,18.
בתגובה לפעילות האנטי-ויראלית הרחבה והחזקה של PKR, וירוסים רבים התפתחו לפחות אסטרטגיה אחת כדי למנוע הפעלת PKR. רוב poxviruses לבטא שני האנטוניסטים PKR, מקודד על ידי E3L ו K3L גנים ב VACV, אשר מרגיז PKR באמצעות שני מנגנונים נפרדים19. E3 מונע pkr הומומיזציה על ידי מחייב כפול תקוע RNA20,21, בעוד K3 משמש מעכבי מדומה במצע על ידי קשירה ישירות pkr מופעל ובכך מעכב אינטראקציה עם המצע שלה eIF2α22. הדבר החשוב ביותר הוא ששני האנטניסטים האלה אינם מעכבים בהכרח את PKR מכל המינים. לדוגמה, הK3 הומולוג מנגיף הטיח מעכבות מאוד את הצאן מכבשים, ואילו הוולוג באמצעות הפלאפון E3 הומולוג לא הראה באופן משמעותי את העיכוב pkr23,24. במחקר זה, אנו מציגים שיטה להשתמש PKR-תיווך בלחץ סלקטיבי בשילוב עם בחירת הזריחה כדי ליצור רקומביננטי VACV נמחק עבור E3L ו K3L (VC-4), אשר לא יכול לשכפל בתאים המוסמכים PKR נגזר ממינים שונים. וירוס רקומביננטי זה מספק רקע מצוין עבור הדור המהיר של וירוסים רקומביננטי ביטוי גנים תחת שליטה של מקדם E3L מקורי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים וריאציה של אסטרטגיה בחירת סמן ארעי 32 כדי ליצור וירוסים רקומביננטי vaccinia ללא שמירה על DNA זר בווירוס רקומביננטי הסופי. האסטרטגיה שלנו עושה שימוש בלחץ סלקטיבי בתיווך על ידי המארחים אנטי חלבון PKR ולא צורות אחרות של לחץ סלקטיבי כגון אנטיביוטיקה. השימוש של גנים ויראלי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות (AI114851) ל-SR.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
