Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie
Summary
Dit is een methode om “scarless” recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.
Abstract
Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel in de uitroeiing van variola virus (VARV), de veroorzaker van pokken, uit de natuur. Sinds het eerste gebruik als vaccin is VACV ontwikkeld als vector voor therapeutische vaccins en als oncolytisch virus. Deze toepassingen maken gebruik van VACV’s gemakkelijk gemanipuleerde genoom en brede host bereik als een uitstekend platform om recombinante virussen te genereren met een verscheidenheid aan therapeutische toepassingen. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om recombinant VACV te genereren, waaronder markerselectiemethoden en tijdelijke dominante selectie. Hier presenteren we een verfijning van een selectiemethode voor het hostbereik in combinatie met visuele identificatie van recombinante virussen. Onze methode maakt gebruik van selectieve druk gegenereerd door de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) in combinatie met een fluorescerend fusie-gen uitdrukken mCherry-tagged E3L, een van de twee VACV PKR antagonisten. De cassette, inclusief het gen van belang en de mCherry-E3L fusie wordt geflankeerd door sequenties afgeleid van het VACV genoom. Tussen het gen van belang en mCherry-E3L is een kleiner gebied dat identiek is aan de eerste ~ 150 nucleotiden van de 3 ‘arm, ter bevordering van homologe recombinatie en verlies van de mCherry-E3L gen na selectie. We tonen aan dat deze methode een efficiënte, naadloze generatie rVACV mogelijk maakt in verschillende celtypen zonder dat er medicijnselectie of uitgebreide screening op gemuteerde virussen nodig is.
Introduction
Vaccinia virus (VACV) was instrumenteel voor de eerste succesvolle uitroeiing van een menselijke ziekteverwekker, variola virus (VARV), uit de natuur. Sinds de uitroeiing van het variolavirus zijn poxvirussen, waaronder VACV, nog steeds nuttige therapeutische virussen voor zowel de menselijke als de diergeneeskunde. Zo is een vaccin tegen rabiës door VACV zeer effectief geweest bij het voorkomen van overdracht van sylvatische rabiës in Europa1 en de Verenigde Staten2. Meer recent hebben recombinante poxvirussen die een verscheidenheid aan anti-tumormoleculen uitdrukken (bijvoorbeeld single-chain antilichamen of menselijke erythropoietine) bemoedigend succes gezien als oncolytische middelen3,4,5. VACV is bijzonder aantrekkelijk als vector omdat het gemakkelijk vatbaar is voor genetische manipulatie, beschikt over een breed scala aan gastheer, en het is stabiel onder een verscheidenheid van voorwaarden, waardoor gemakkelijk transport en vaccin levensvatbaarheid in het veld6,7. Terwijl meerdere technieken zijn ontwikkeld om recombinant VACV genereren voor laboratoriumexperimenten en vaccin generatie, huidige strategieën om deze virussen te genereren hebben opmerkelijke beperkingen.
Vanwege het nut van VACV zijn er meerdere strategieën ontwikkeld om recombinante virussen te genereren. De eerste strategie maakt gebruik van homologe recombinatie om een cassette met het transgene en een selecteerbaar markergen zoals een antibioticaresistentiegen te introduceren. De cassette wordt geflankeerd door twee ~ 500 nucleotiden (nt) of grotere armen die het gen naar een specifieke plaats in het virale genoom leiden, die vervolgens stabiel wordt geïntegreerd door dubbele crossover gebeurtenissen8,9,10. Deze strategie is snel en efficiënt; het resulteert echter in extra genetisch materiaal in de vorm van het markergen dat onverwachte effecten kan veroorzaken. Bovendien is er een praktische bovengrens aan het aantal transgenen dat kan worden ingevoerd beperkt door het aantal unieke selecteerbare markers beschikbaar. Voorbijgaande dominante selectie (TDS) strategieën hebben dit probleem aangepakt door het vergemakkelijken van de generatie van “littekenloze” recombinant virussen11. Met behulp van deze strategie worden een plasmide met een gemuteerd VACV-gen en een selecteerbaar markergen geïntegreerd in het virale genoom, maar zonder extra flankerend VACV-DNA. Deze aanpak resulteert in een tijdelijke integratie van het gehele plasmideen en duplicatie van het VACV-gen als gevolg van integratie door één cross-overgebeurtenis. Dit tussenproduct is stabiel zolang het onder selectiedruk wordt gehandhaafd, waardoor verrijking van deze constructie mogelijk is. Wanneer de selectie wordt verwijderd, maakt de VACV-duplicatie een tweede crossover-gebeurtenis mogelijk die resulteert in het verwijderen van het plasmilaatpunt en de daaropvolgende vorming van het wilde type (wt) of recombinantvirus in een verhouding van ongeveer 50:50. Terwijl TDS recombinante virussen genereert zonder de stabiele introductie van vreemd DNA, moeten meerdere virusklonen worden gescreend op de verwachte mutatie door sequencing analyse, een potentieel tijdrovende en kostbare stap.
Hier presenteren we een benadering voor het genereren van recombinante pokkenvirussen die de beste aspecten van elk van deze benaderingen combineren, vergelijkbaar met een benadering die is beschreven voor de replicatie incompetente gemodificeerde vaccinia Ankara12,13,14. Deze strategie combineert visuele en gastheer bereik selectie om snel recombinante virussen te genereren door dubbele crossover gebeurtenissen, en vervolgens elimineren van de selecteerbare marker gen door homologe recombinatie. Deze aanpak maakt de snelle generatie mutanten bemiddeld door homologe recombinatie, met de “littekenloze” aard van TDS benaderingen, terwijl niet vereist een latere screening stap om wilde type en mutant virussen te onderscheiden. Onze methode maakt ook gebruik van gastheer bereik selectie in plaats van antibiotica selectie, waardoor het risico van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellijn. Voor deze aanpak hebben we ervoor gekozen om de gastheer antivirale eiwit kinase R (PKR) te gebruiken als het selectieve middel om recombinant VACV te genereren. PKR wordt uitgedrukt als een inactieve monomeer in de meeste celtypen15. Na het binden van dubbelstrengs RNA (dsRNA) bij de N-terminal dsRNA-bindende domeinen, dimerizes PKR en wordt autophosphorylated16. Deze actieve vorm van PKR-fosforylaatse de alfa-subeenheid van de eukaryotische initiatiefactor 2 (eIF2) remt uiteindelijk de levering van initiator methionyl-tRNA aan het rinoom, waardoor intracellulaire vertaling wordt voorkomen en de replicatie van veel virusfamilies17,18in grote lijnen wordt geremd .
In reactie op de brede en krachtige antivirale activiteit van PKR, veel virussen hebben ontwikkeld ten minste een strategie om PKR activering te voorkomen. De meeste poxvirussen drukken twee PKR antagonisten uit, gecodeerd door de E3L en K3L genen in VACV, die PKR door twee verschillende mechanismen antagonize19. E3 voorkomt PKR homodimerisatie door binding van dubbelstrengs RNA20,21, terwijl K3 fungeert als een pseudosubstraatremmer door direct te binden aan geactiveerde PKR en daarmee de interactie met het substraat eIF2α22te remmen . Belangrijk is dat deze twee PKR-antagonisten pkr niet noodzakelijkerwijs van alle soorten remmen. Zo remde de K3 homolog van het schapenpokkenvirus PKR sterk van schapen, terwijl de schapenpokken E3 homolog geen aanzienlijke PKR-remming23,24. In deze studie presenteren we een methode om PKR-gemedieerde selectieve druk te gebruiken in combinatie met fluorescentieselectie om een VACV-recombinant te genereren die is verwijderd voor E3L en K3L (VC-R4), die niet kunnen repliceren in PKR-competente cellen afkomstig van verschillende soorten. Dit recombinant virus biedt een uitstekende achtergrond voor snelle generatie van recombinante virussen uitdrukken genen onder controle van de inheemse E3L promotor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we een variatie van een voorbijgaande marker selectie strategie 32 om recombinant vaccinia virussen te genereren zonder het behoud van vreemd DNA in de uiteindelijke recombinant virus. Onze strategie maakt gebruik van selectieve druk bemiddeld door de gastheer antivirale eiwit PKR in plaats van andere vormen van selectieve druk, zoals antibiotica. Het gebruik van gastheer antivirale genen elimineert de mogelijkheid van chemisch geïnduceerde fenotypische veranderingen in de cellen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door de National Institutes of Health (AI114851) aan SR.
Materials
| 2X-Q5 Master Mix | NEB | M0492L | High-fidelity polymerase used in PCR |
| Ampicillin | ThermoFisher Scientific | 11593027 | Bacterial selective agent |
| Disposable Cell Scrapers | ThermoFisher Scientific | 08-100-242 | Cell scraper to harvest infected cells |
| EVOS FL Auto 2 Cell imaging system | ThermoFisher Scientific | AMAFD2000 | Fluorescent microscope |
| EVOS Light Cube, GFP | ThermoFisher | AMEP4651 | GFP Cube |
| EVOS Light Cube, RFP | ThermoFisher | AMEP4652 | RFP Cube |
| GenJet | SignaGen Laboratories | SL100489 | Transfection reagent |
| Luria Bertani (LB) Broth | Gibco | 10855021 | Bacterial growth medium |
| Monarch DNA gel extraction kit | NEB | T1020L | Gel purification kit used to purify amplicons and linearized vectors |
| Monarch Plasmid Miniprep kit | NEB | T1010L | Miniprep kit ussed to purify plasmids |
| NanoDrop One | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | Spectrophotometer used to measure RNA and DNA concentration |
| NEBuilder Master Mix | NEB | E2621L | Isothermal enzymatic assembly kit used to generate the recombination vector |
| Q500 Sonicator | Qsonica | Q500-110 | Sonicator for virus lysates |
| RK13 cells | ATCC | CCL-37 | Rabbit kidney cells |
| VWR Multiwell Cell Culture plates | VWR | 10062-892 | Cell culture plates |
References
- Brochier, B., et al. Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabies vaccine. Nature. 354 (6354), 520-522 (1991).
- Pastoret, P. P., Brochier, B. The development and use of a vaccinia-rabies recombinant oral vaccine for the control of wildlife rabies; a link between Jenner and Pasteur. Epidemiology and Infection. 116 (3), 235-240 (1996).
- Chan, W. M., McFadden, G. Oncolytic Poxviruses. Annual review of virology. 1 (1), 119-141 (2014).
- Nguyen, D. H., et al. Vaccinia virus-mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice. Molecular Therapy. 21 (11), 2054-2062 (2013).
- Frentzen, A., et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12915-12920 (2009).
- Pastoret, P. P., Vanderplasschen, A. Poxviruses as vaccine vectors. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. 26 (5-6), 343-355 (2003).
- COLLIER, L. H. The development of a stable smallpox vaccine. The Journal of Hygiene. 53 (1), 76-101 (1955).
- Weir, J. P., Bajszár, G., Moss, B. Mapping of the vaccinia virus thymidine kinase gene by marker rescue and by cell-free translation of selected mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (4), 1210-1214 (1982).
- Mackett, M., Smith, G. L., Moss, B. Vaccinia virus: a selectable eukaryotic cloning and expression vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (23), 7415-7419 (1982).
- Nakano, E., Panicali, D., Paoletti, E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (5), 1593-1596 (1982).
- Falkner, F. G., Moss, B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. 64 (6), 3108-3111 (1990).
- Staib, C., Drexler, I., Ohlmann, M., Wintersperger, S., Erfle, V., Sutter, G. Transient Host Range Selection for Genetic Engineering of Modified Vaccinia Virus Ankara. BioTechniques. 28 (6), 1137-1148 (2000).
- Staib, C., Drexler, I., Sutter, G. Construction and Isolation of Recombinant MVA. Vaccinia Virus and Poxvirology. , 77-99 (2004).
- Di Lullo, G., et al. Marker gene swapping facilitates recombinant Modified Vaccinia Virus Ankara production by host-range selection. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 37-43 (2009).
- Pfaller, C. K., Li, Z., George, C. X., Samuel, C. E. Protein kinase PKR and RNA adenosine deaminase ADAR1: New roles for old players as modulators of the interferon response. Current Opinion in Immunology. 23 (5), 573-582 (2011).
- Bevilacqua, P. C., George, C. X., Samuel, C. E., Cech, T. R. Binding of the protein kinase PKR to RNAs with secondary structure defects: Role of the tandem A – G mismatch and noncontigous helixes. Biochemistry. 37 (18), 6303-6316 (1998).
- Krishnamoorthy, T., Pavitt, G. D., Zhang, F., Dever, T. E., Hinnebusch, A. G. Tight Binding of the Phosphorylated Subunit of Initiation Factor 2 (eIF2) to the Regulatory Subunits of Guanine Nucleotide Exchange Factor eIF2B Is Required for Inhibition of Translation Initiation. Molecular and Cellular Biology. 21 (15), 5018-5030 (2001).
- Rothenburg, S., Georgiadis, M. M., Wek, R. C. Evolution of eIF2α kinases: Adapting translational control to diverse stresses. Evolution of the Protein Synthesis Machinery and Its Regulation. , 235-260 (2016).
- Bratke, K. A., McLysaght, A., Rothenburg, S. A survey of host range genes in poxvirus genomes. Infection, Genetics and Evolution. 14, 406-425 (2013).
- Chang, H. W., Watson, J. C., Jacobs, B. L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (11), 4825-4829 (1992).
- Romano, P. R., et al. Inhibition of double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR by vaccinia virus E3: role of complex formation and the E3 N-terminal domain. Molecular and Cellular Biology. 18 (12), 7304-7316 (1998).
- Beattie, E., Tartaglia, J., Paoletti, E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. Virology. 183 (1), 419-422 (1991).
- Park, C., Peng, C., Brennan, G., Rothenburg, S. Species-specific inhibition of antiviral protein kinase R by capripoxviruses and vaccinia virus. Annals of the New York Academy of Sciences. 1438 (1), 18-29 (2019).
- Rothenburg, S., Brennan, G. Species-Specific Host-Virus Interactions: Implications for Viral Host Range and Virulence. Trends in Microbiology. , (2019).
- Chakrabarti, S., Sisler, J. R., Moss, B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. BioTechniques. 23 (6), 1094-1097 (1997).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution (recombinant DNA). Biochemistry. 86, 2172-2175 (1989).
- Chung, C. T., Miller, R. H. Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods in Enzymology. 218, 621-627 (1993).
- Rahman, M. M., Liu, J., Chan, W. M., Rothenburg, S., McFadden, G. Myxoma Virus Protein M029 Is a Dual Function Immunomodulator that Inhibits PKR and Also Conscripts RHA/DHX9 to Promote Expanded Host Tropism and Viral Replication. PLOS Pathogens. 9 (7), 1003465 (2013).
- Evans, D. H., Stuart, D., McFadden, G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. Journal of Virology. 62 (2), 367-375 (1988).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. Journal of Virology. 61 (6), 1788-1795 (1987).
- Spyropoulos, D. D., Roberts, B. E., Panicali, D. L., Cohen, L. K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. Journal of Virology. 62 (3), 1046-1054 (1988).
- Liu, L., et al. Transient dominant host-range selection using Chinese hamster ovary cells to generate marker-free recombinant viral vectors from vaccinia virus. BioTechniques. 62 (4), 183-187 (2017).
