Fare Meme Epitel HC11 ve EpH4 Hücrelerinin Farklılaşması
Summary
Biz iki meme epitel hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon teknikleri açıklayın. Her ikisi de süt proteinleri üretmek için fetal buzağı serumu, insülin ve prolaktin gerektirirken, EpH4 hücreleri üç boyutlu kültürde mammospheres içine tam olarak ayırt edebilirsiniz. Bu tamamlayıcı modeller farklılaşma ve neoplazi sinyal iletimi çalışmaları için yararlıdır.
Abstract
Kadherinler hücre farklılaşmasının düzenlenmesinde ve neoplazide önemli rol oynarlar. Burada iki fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 farklılaşma indüksiyon uyupasyon ve meme bezi gelişimi ve neoplastik dönüşüm tamamlayıcı aşamaları çalışma da bunların kullanımı açıklar.
HC11 fare meme epitel hücre hattı hamile bir Balb / c fare meme bezi kökenli. Fetal baldır serumu ve Hydrokortizon, Insulin ve Prolactin (HIP medium) içeren orta derecede plastik Petri kabı yüzeyine bağlı olarak biraraya geldiğinde farklılaşır. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri süt proteinleri β-kazein ve peynir altı suyu asidik protein (WAP), emziren meme epitel hücrelerine benzer üretmek ve “kubbe” olarak adlandırılır ilkel meme bezi benzeri yapılar oluştururlar.
EpH4 hücre hattı, hamile bir Balb/c fareden izole edilmiş kendiliğinden ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücrelerinden türetilmiştir. HC11’in aksine, EpH4 hücreleri HIP ortamda üç boyutlu (3D) büyüme koşulları altında kültürlendiğinde küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) tam olarak ayırt edilebilirler. Hücreler, Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkom hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin karışımından oluşan %20’lik bir matris içinde, plastik petri kabını veya çok kuyulu plakayı kaplayan konsantre matris tabakasının üzerine kaplanmış ve %10 matris içeren HIP ortamı tabakası ile kaplanır. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite, içi boş bir lümen sergileyen ve β-kazein ve WAP üreten içi boş küreseller oluştururlar.
Bu teknikleri kullanarak, sonuçlarımız cadherin/Rac sinyalinin yoğunluğunun HC11 hücrelerinin farklılaşması için kritik öneme sahip olduğunu göstermiştir. Rac1 farklılaşma ve aktive RacV12 artış farklılaşma düşük seviyelerde için gerekli iken, yüksek RacV12 düzeyleri neoplazi indüklerken farklılaşmayı engeller. Buna karşılık, EpH4 hücreleri meme epitelyal diferansiyasyon daha önceki bir aşamayı temsil, Hangi RacV12bile düşük seviyelerde inhibe edilir .
Introduction
Normal dokularda veya tümörlerde, hücreler üç boyutlu bir organizasyonda komşularına yapışma için geniş fırsatlara sahiptir ve bu da kültürde yüksek yoğunluklu hücre büyümesi ile taklit edilir. Hücre-hücre adezyonu esas olarak hücre ve doku mimarisini tanımlayan kadherin reseptörleri aracılığıyla aracılık edilir. İlginçtir, son zamanlarda kadherinler de sinyal iletimi güçlü bir rol oynadığı gösterilmiştir, özellikle hayatta kalma sinyalizasyon1. Paradoksal olarak, kadherinlerden yayılan bu hücreden hücreye yapışma sinyallerinin bir kısmının yakın zamanda hem farklılaşma hem de neoplazi2ile paylaşıldığı bulunmuştur. Burada fare meme epitel hücre hatları, HC11 ve EpH4 iki temsili tip tedisiyasyon indüksiyon ve değerlendirme yöntemleri açıklanmıştır.
HC11 fare meme epitel hücre hattı epitel hücre farklılaşması çalışma için yararlı bir model sağlayabilir. HC11 hücreleri, orta gebe balb/c fare3’ünmeme bezinden kaynaklanan, VIRGÜL-1D türetilmiş bir hücre hattıdır. Diğer VIRMAN-1D türevi klonların aksine, HC11 klonu ekselolarak ekselansları ekstrasellüler matriks veya laktojenik hormonlar tarafından endojen β-kazein geninin in vitro indüksiyonu için diğer hücre tipleri ile birlikte eklenme gereksinimi yoktur3. Bu hücre hattı, normal meme epitelinin önemli özelliklerini koruduğu için ayırım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmıştır: HC11 hücreleri kısmen temizlenmiş bir meme yağ yastığında duktal epiteli yeniden oluşturabilir4. Ayrıca, h ydrokortizon veya Deksametazon gibi bir steroid varlığında plastik petri çanak yüzeyine bağlı biraraya yetiştirilen bir iki boyutlu (2D) kültür ayırt edebilirsiniz, Insulin ve Prolactin ek olarak (HIP orta) epidermal büyüme faktörü yoksun (EGF), farklılaşma bir inhibitörü5,6,7. Bu koşullar altında, HC11 hücreleri β-kazin ve WAP gibi süt proteinleri üretirler ve indüksiyondan sonraki 4 gün içinde Batı lekeleme ile saptanabilir. Aynı zamanda, HC11 hücrelerinin bir kısmı stochastic bir şekilde “kubbeler” olarak adlandırdığı temel meme bezi benzeri yapılar oluşturur. Kubbeler indüksiyondan 4-5 gün sonra görülebilir ve 10. İlginçtir, HC11 hücreleri mutant p539sahip , ve bu nedenle bir preneoplastik devlet temsil eder. Bu nedenle, HC11 modeli ideal aynı hücre sisteminde neoplazi ile birlikte farklılaşma sinyal ağları çalışmak için uygundur.
EPH4 hücreleri, IM-2 hücrelerinin bir türevi, bir nontumorigenic hücre hattı aslında bir orta hamile Balb / c fare izole spontan ölümsüzleştirilmiş fare meme bezi epitel hücreleri türetilmiştir10. EpH4 hücreleri 2D kültürde sürekli epitel monolayers formu, ancak glandüler benzeri yapılar10,11ayırt yok. Ancak, EHS fare sarkomu hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler matriks proteinlerinin bir karışımından oluşan bir malzemede 3D büyüme sonrasında12 (EHS matris, matris veya Matrigel, Bkz. Malzeme Tablosu),HIP ile uyarılmaya ek olarak, EpH4 hücreleri meme bezi farklılaşmasının ilk aşamalarını özetleyebilir. Bu koşullar altında, EpH4 hücreleri apical-bazal polarite ve içi boş bir lümen sergileyen küresel (mammospheres olarak da adlandırılır) oluştururlar ve süt proteinleri β-kazin ve WAP üretme yeteneğine sahiptirler, emziren meme epitel hücrelerine benzer. Farklılaşmamış HC11 hücrelerinin aksine, ve bazı ekspres mezenkimal belirteçler13, EpH4 hücreleri tamamen luminal morfolojisi sergiler14. EpH4 hücrelerinin de deksametazon, insülin ve prolaktin15ile stimülasyon yoluyla 2D kültürde süt proteinleri üretmek için bildirilmiştir. Ancak bu yaklaşım, 3D kültürde meme bezi mikroçevresini taklit eden düzenleyici etkilerin araştırılmasını engellemektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11 hücreleri neoplastik transformasyon ile birlikte farklılaşma çalışmaları için idealdir. Ek bir avantajı HC11 hücreleri kolayca Mo-MLV tabanlı retroviral vektörler ile genlerin çeşitli ifade etmek için enfekte olmasıdır. Elimizde, EpH4 hücreleri HC112daha aynı retroviral vektörleri ile enfekte daha zordu.
Hücreden hücreye temas ve büyüme durması HC11 hücre farklılaşmasıiçin önemli ön koşullardır. Bu nedenle, hücre tabakası arasın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HC11 hücre hattı dr. D. Medina (Houston, TX) tarafından sağlanmıştır. Yazarlar Dr Andrew Craig Queen’s Üniversitesi birçok reaktifler ve değerli öneriler için müteşekkiriz. EpH4 hücreleri Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver) tarafından hediye edildi. Colleen Schick 3D kültür çalışmaları için mükemmel teknik yardım sağladı.
Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Kanada Meme Kanseri Vakfı (CBCF, Ontario Bölüm), Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı mali yardım , Ontario Mükemmellik Merkezleri, Meme Kanseri Eylem Kingston (BCAK) ve LR hibe yoluyla Clare Nelson miras fonu minnetle kabul edilmektedir. BE CIHR, CBCF, BCAK ve Kanser Araştırma Derneği A.Ş. PTG bir Kanada Araştırma Başkanı, Kanada Yenilik Vakfı, CIHR, NSERC ve Kanada Kanser Derneği tarafından desteklenir hibe desteği aldı. MN NCIC’den Disiplinlerarası Kanser Araştırmaları Terry Fox Eğitim Programı’ndan bir öğrencilik, Bir Lisansüstü ödülü (QGA) ve Queen’s University’den Dekan Ödülü ile desteklenmiştir. MG, ABD Ordusu Meme Kanseri Programı, Ontario Eyaleti Araştırma ve Yenilik Bakanlığı ve Queen’s University Danışma Araştırma Komitesi’nden doktora sonrası burslar tarafından desteklendi. VH, CIHR ile işbirliği içinde Terry Fox Vakfı Eğitim Programı’ndan Bir CBCF doktora bursu ve doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. Hanad Adan Bir NSERC yaz öğrencilik alıcı oldu. BS, Queen’s University lisansüstü ödülü ile desteklendi.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
