Differenziazione delle cellule epiteliali del seno del topo HC11 e EpH4
Summary
Descriviamo tecniche per l’induzione della differenziazione di due linee epiteliali mammarie, HC11 ed EpH4. Mentre entrambi richiedono siero di vitello fetale, insulina e prolattina per produrre proteine del latte, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in mammosfere in coltura tridimensionale. Questi modelli complementari sono utili per gli studi di trasduzione del segnale di differenziazione e neostrulasia.
Abstract
I cadherin svolgano un ruolo importante nella regolazione della differenziazione cellulare e della neoplasia. Qui descriviamo le origini e i metodi dell’induzione della differenziazione di due linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 ed EpH4, e il loro uso per studiare fasi complementari dello sviluppo della ghiandola mammaria e della trasformazione neoplastica.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 ha avuto origine dalla ghiandola mammaria di un topo balb/c incinta. Si differenzia quando viene coltivato alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto Petri di plastica in un mezzo contenente siero di vitello fetale e Hydrocortisone, Insulin e Prolactin (medium HIP). In queste condizioni, le cellule HC11 producono le proteine del latte proteina acida (WAP), simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano, e formano rudimentali strutture simili a ghiandole mammarie definite “cupole”.
La linea cellulare EpH4 è stata derivata da cellule epiteliali mammarie topoimmortalizzate spontaneamente isolate da un topo balb/c incinta. A differenza dell’HC11, le cellule EpH4 possono differenziarsi completamente in sferoidi (chiamati anche mammosferie) quando coltivate in condizioni di crescita tridimensionali (3D) nel mezzo HIP. Le cellule sono ortopsinizzate, sospese in una matrice del 20% costituita da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte da cellule di sarcoma tono Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), placcate sopra uno strato di matrice concentrata che riveste una piastra Petri di plastica o piastra multiwell, e coperte da uno strato di mezzo HIP composto da matrice del 10%. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi cavi che presentano polarità apicale-basale, un lume cavo, e producono la caseina e la WAP.
Utilizzando queste tecniche, i nostri risultati hanno dimostrato che l’intensità del segnale cadherin/Rac è fondamentale per la differenziazione delle cellule HC11. Mentre Rac1 è necessario per la differenziazione e bassi livelli di Attivato RacV12 aumentare la differenziazione, alti livelli di RacV12 bloccano la differenziazione mentre inducono neoplasia. Al contrario, le cellule EpH4 rappresentano una fase precedente nella differenziazione epiteliale mammaria, che è inibita anche da bassi livelli di RacV12.
Introduction
Nei tessuti normali o tumori, le cellule hanno ampie opportunità di adesione ai loro vicini in un’organizzazione tridimensionale, e questo è imitato nella coltura dalla crescita cellulare ad alta densità. L’adesione da cellula a cellula è mediata principalmente attraverso i recettori della cadherin, che definiscono l’architettura cellulare e tissutale. È interessante notare che è stato recentemente dimostrato che le cadherine svolgono anche un ruolo potente nella trasduzione del segnale, specialmente nella segnalazione di sopravvivenza1. Paradossalmente, alcuni di questi segnali di adesione da cellula a cellula provenienti da cadherins sono stati recentemente trovati per essere condivisi sia dalla differenziazione che dalla neoplasia2. Qui, descriviamo i metodi di induzione e valutazione della differenziazione in due tipi rappresentativi di linee cellulari epiteliali del seno del topo, HC11 e EpH4.
La linea cellulare epiteliale del seno del topo HC11 può fornire un modello utile per lo studio della differenziazione delle cellule epiteliali. Le cellule HC11 sono una linea cellulare derivata da COMMA-1D, proveniente dalla ghiandola mammaria di un topo Balb/c a metà gravidanza3. A differenza di altri cloni derivati COMMA-1D, il clone hC11 non ha alcun requisito per la matrice extracellulare aggiunta esogenao o la cocoltivazione con altri tipi di cellule per l’induzione in vitro del gene endogeno della caseina endogena dagli ormoni lattogenici3 . Questa linea cellulare è stata ampiamente utilizzata negli studi di differenziazione perché ha mantenuto importanti caratteristiche del normale epitelio mammario: le cellule HC11 possono parzialmente ricostituire l’epitelio duttale in un cuscinetto di grasso mammario eliminato4. Inoltre, possono differenziarsi in una coltura bidimensionale (2D) quando coltivati alla confluenza attaccata alla superficie di un piatto di Petri di plastica in presenza di uno steroide come Hydrocortisone o Dexamethasone, oltre a Insulin e Prolactin (media HIP) privo di fattore di crescita epidermica (EGF), un inibitore della differenziazione5,6,7. In queste condizioni, le cellule HC11 producono proteine del latte come la caseina e la WAP, che sono rilevabili dalla gonfiore occidentale entro 4 giorni dall’induzione. Allo stesso tempo, una porzione di cellule HC11 forma strutture rudimentali simili alla ghiandola mammaria definite “cupole” in modo stocastico. Le cupole sono visibili 4-5 giorni dopo l’induzione e aumentano gradualmente di dimensioni fino al giorno 10, concomitanti con un aumento della produzione di banofaz 8. È interessante notare che le cellule HC11 possiedono p539mutanti e quindi rappresentano uno stato preneoplastico. Per questo motivo, il modello HC11 è ideale per studiare le reti di segnalazione di differenziazione in combinazione con la neoplasia nello stesso sistema cellulare.
Le cellule EpH4, un derivato delle cellule IM-2, sono una linea cellulare non tumorale originariamente derivata da cellule epiteliali della ghiandola mammaria del topo immortalate spontaneamente isolate da un topo balb/c medio-gravidanza10. Le cellule EpH4 formano monostrati epiteliali continui in coltura 2D, ma non si differenziano in strutture simili alla ghiandaia10,11. Tuttavia, a seguito della crescita 3D in un materiale costituito da una miscela di proteine a matrice extracellulare prodotte dalle cellule sarcoma del topo EHS12 (matrice EHS, matrice o Matrigel, vedi Tabella dei materiali), oltre alla stimolazione con HIP, le cellule EpH4 possono ricapitolare le fasi iniziali della differenziazione della ghiandola mammaria. In queste condizioni, le cellule EpH4 formano sferoidi (chiamati anche mammosferie) che presentano polarità apicale-basale e un lume cavo, e sono in grado di produrre le proteine del latte, la caseina e la WAP, simili alle cellule epiteliali mammarie che allattano. Contrariamente alle cellule HC11, che sono indifferenziate, e alcuni esprimono marcatori mesenchymal13, cellule EpH4 mostrano una morfologia puramente luminale14. Cellule EpH4 sono stati segnalati anche per produrre proteine del latte nella coltura 2D attraverso la stimolazione con dexamethasone, insulina, e prolattina15. Tuttavia, questo approccio preclude lo studio degli effetti normativi che imitano il microambiente della ghiandola mammaria nella coltura 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cellule HC11 sono ideali per lo studio della differenziazione in combinazione con la trasformazione neoplastica. Un ulteriore vantaggio è che le cellule HC11 sono facilmente infettivabili con vettori retrovirali basati su Mo-MLV per esprimere una varietà di geni. Nelle nostre mani, le cellule EpH4 erano più difficili da infettare con gli stessi vettori retrovirali di HC112.
Il contatto tra celle e l’arresto della crescita sono i prerequisiti fondamentali per la di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La linea cellulare HC11 è stata gentilmente fornita dal Dr. D. Medina (Houston, TX). Gli autori sono grati al Dr. Andrew Craig della Queen’s University per molti reagenti e preziosi suggerimenti. Le cellule EpH4 sono state un dono del Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick ha fornito un’eccellente assistenza tecnica per gli studi di cultura 3D.
L’assistenza finanziaria del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), dei Canadian Institutes of Health Research (CIHR), della Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), della Canadian Breast Cancer Research Alliance , i Centri di Eccellenza dell’Ontario, il Breast Cancer Action Kingston (BCAK) e il fondo di lascile Clare Nelson attraverso sovvenzioni a LR sono riconosciuti con gratitudine. BE ha ricevuto il sostegno da CIHR, CBCF, BCAK e Cancer Research Society Inc. PTG è supportato da un presidente di ricerca canadese, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC e Canadian Cancer Society. MN è stato supportato da una nave da uno studente del Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research di NCIC, un Graduate Award (QGA) e un Dean’s Award della Queen’s University. MG è stata sostenuta da borse di studio post-dottorato del Programma per il cancro al seno dell’esercito degli Stati Uniti, del Ministero della Ricerca e dell’Innovazione della Provincia dell’Ontario e del Comitato consultivo di ricerca della Queen’s University. VH è stata sostenuta da una borsa di dottorato CBCF e da una borsa di studio post-dottorato del Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in collaborazione con CIHR. Hanad Adan è stato il destinatario di uno studio estivo NSERC. LA BS è stata sostenuta da un premio di laurea della Queen’s University.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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