Differentiatie van muisborst epitheel HC11 en EpH4 Cellen
Summary
We beschrijven technieken voor differentiatie-inductie van twee borstepitheellijnen, HC11 en EpH4. Terwijl beide foetale kalf serum, insuline, en prolacactine nodig om melkeiwitten te produceren, EpH4 cellen kunnen volledig onderscheiden in mammosferen in driedimensionale cultuur. Deze complementaire modellen zijn nuttig voor signaaltransductiestudies van differentiatie en neoplasie.
Abstract
Cadherinen spelen een belangrijke rol in de regulering van celdifferentiatie en neoplasie. Hier beschrijven we de oorsprong en methoden van de inductie van differentiatie van twee muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4, en het gebruik ervan om complementaire stadia van borstklierontwikkeling en neoplastische transformatie te bestuderen.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn is afkomstig van de borstklier van een zwangere Balb/c muis. Het onderscheidt wanneer gekweekt aan samenvloeiing die aan een plastic petrischaaloppervlak in middel met foetale kalfsserum en Hydrocortisone, Iknsulin en Prolactin (ship medium) wordt vastgemaakt. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen de melkeiwitten β-caseïne en weizuureiwit (WAP), vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen, en vormen rudimentaire borstklierachtige structuren die “koepels” worden genoemd.
De EpH4 cellijn is afgeleid van spontaan vereeuwigde muisborstklier epitheelcellen geïsoleerd van een zwangere Balb/c muis. In tegenstelling tot HC11 kunnen EpH4-cellen zich volledig onderscheiden in sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) wanneer ze worden gekweekt onder driedimensionale (3D) groeiomstandigheden in HIP medium. Cellen worden beproefd, opgehangen in een 20% matrix bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muis sarcoom cellen, verguld op de top van een laag geconcentreerde matrix coating een plastic petrischaal of multiwell plaat, en bedekt met een laag van 10% matrix-bevattende HIP medium. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen holle sferoïden die apical-basale polariteit vertonen, een holle lumen, en β-caseine en WAP produceren.
Met behulp van deze technieken, onze resultaten aangetoond dat de intensiteit van de cadherin / Rac signaal is van cruciaal belang voor de differentiatie van HC11 cellen. Terwijl Rac1 is noodzakelijk voor differentiatie en lage niveaus van geactiveerde RacV12 verhoging differentiatie, hoge RacV12 niveaus blok differentiatie terwijl het induceren van neoplasie. EpH4-cellen daarentegen vertegenwoordigen een vroeger stadium in borstepitheeldifferentiatie, die wordt geremd door zelfs lage niveaus van RacV12.
Introduction
In normale weefsels of tumoren, cellen hebben uitgebreide mogelijkheden voor hechting aan hun buren in een driedimensionale organisatie, en dit wordt nagebootst in cultuur door hoge dichtheid celgroei. Cel-op-cel hechting wordt voornamelijk bemiddeld via cadherinreceptoren, die cel- en weefselarchitectuur definiëren. Interessant is dat onlangs werd aangetoond dat cadherinen ook een krachtige rol spelen bij signaaltransductie, vooral bij overlevingssignalering1. Paradoxaal genoeg bleken sommige van deze cel-op-cel hechtingssignalen afkomstig van cadherinen onlangs te worden gedeeld door zowel differentiatie als neoplasie2. Hier beschrijven we methoden voor inductie en beoordeling van differentiatie in twee representatieve soorten muisborst epitheliale cellijnen, HC11 en EpH4.
De HC11 muisborst epitheliale cellijn kan een nuttig model voor de studie van epitheelceldifferentiatie. HC11 cellen zijn een COMMA-1D-afgeleide cellijn, afkomstig van de borstklier van een halfzwangere Balb/c muis3. In tegenstelling tot andere COMMA-1D afgeleide klonen, de HC11 kloon heeft geen behoefte aan exogene toegevoegde extracellulaire matrix of coteelt met andere celtypes voor de in vitro inductie van het endogene β-caseingen door lactogene hormonen3. Deze cellijn is op grote schaal gebruikt in differentiatiestudies omdat het belangrijke kenmerken van het normale borstepitheel heeft behouden: HC11-cellen kunnen het kanaalepitheel gedeeltelijk reconstrueren in een gewist borstvetpad4. Bovendien kunnen ze zich onderscheiden in een tweedimensionale (2D) cultuur wanneer ze worden gekweekt tot samenvloeiing aan een plastic petrischaaloppervlak in aanwezigheid van een steroïde zoals Hydrocortison of Dexamethason, naast Insulin en Prolactin (HIP medium) die epidermale groeifactor (EFG) missen, een remmer van differentiatie5,6,7. Onder deze omstandigheden produceren HC11-cellen melkeiwitten zoals β-caseïne en WAP, die binnen 4 dagen na inductie door westerse vlekken kunnen worden gedetecteerd. Tegelijkertijd vormt een deel van hc11 cellen rudimentaire borstklierachtige structuren die op een stochastische manier “koepels” worden genoemd. Koepels zijn zichtbaar 4-5 dagen na inductie en geleidelijk toenemen in omvang tot dag 10, gelijktijdig met een toename van β-caseine productie8. Interessant is dat HC11 cellen bezitten mutant p539, en dus vertegenwoordigen een preneoplastic staat. Om deze reden is het HC11-model bij uitstek geschikt om signaleringsnetwerken van differentiatie te bestuderen in combinatie met neoplasie in hetzelfde celsysteem.
EpH4 cellen, een afgeleide van IM-2 cellen, zijn een niet-tumorigene cellijn oorspronkelijk afgeleid van spontaan vereeuwigde muis borstklier epitheelcellen geïsoleerd van een mid-zwangere Balb / c muis10. EpH4 cellen vormen continue epitheelmonolagen in de 2D-cultuur, maar onderscheiden zich niet in klierachtige structuren10,11. Echter, na 3D-groei in een materiaal bestaande uit een mengsel van extracellulaire matrix eiwitten geproduceerd door EHS muis sarcoom cellen12 (EHS matrix, matrix, of Matrigel, zie Tabel met materialen), in aanvulling op stimulatie met HIP, EpH4 cellen kunnen recapituleren de eerste stadia van borstklier differentiatie. Onder deze omstandigheden vormen EpH4-cellen sferoïden (ook wel mammosferen genoemd) die apical-basale polariteit en een holle lumen vertonen, en die in staat zijn de melkeiwitten β-caseïne en WAP te produceren, vergelijkbaar met zogende borstepitheelcellen. In tegenstelling tot HC11 cellen, die ongedifferentieerd zijn, en sommige uitdrukken mesenchymale markers13, EpH4 cellen vertonen een zuiver luminale morfologie14. EpH4 cellen zijn ook gemeld aan melkeiwitten te produceren in 2D-cultuur door stimulatie met dexamethason, insuline, en prolacactine15. Deze aanpak sluit echter de studie uit van regelgevende effecten die de borstkliermicroomgeving in de 3D-cultuur nabootsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11 cellen zijn bij uitstek geschikt voor de studie van differentiatie in combinatie met neoplastische transformatie. Een bijkomend voordeel is dat HC11-cellen gemakkelijk te infecteren zijn met Mo-MLV-gebaseerde retrovirale vectoren om een verscheidenheid aan genen uit te drukken. In onze handen, EpH4 cellen waren moeilijker te infecteren met dezelfde retrovirale vectoren dan HC112.
Cell-to-cell contact en groeiarrestatie zijn belangrijke voorwaarden voor HC11 celdiff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De HC11 cellijn werd vriendelijk verstrekt door Dr. D. Medina (Houston, TX). De auteurs zijn dr. Andrew Craig van Queen’s University dankbaar voor vele reagentia en waardevolle suggesties. EpH4 cellen waren een geschenk van Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leverde uitstekende technische ondersteuning voor 3D-cultuurstudies.
De financiële steun van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), de Canadian Institutes of Health Research (CIHR), de Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), de Canadian Breast Cancer Research Alliance , de Ontario Centres of Excellence, de Breast Cancer Action Kingston (BCAK) en de Clare Nelson legaat fonds door middel van subsidies aan LR is dankbaar erkend. BE ontving subsidiesteun van CIHR, CBCF, BCAK en Cancer Research Society Inc. PTG wordt ondersteund door een Canada Research Chair, Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC en Canadian Cancer Society. MN werd ondersteund door een studentenschap van het Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research van NCIC, een Graduate award (QGA), en een Dean’s Award van Queen’s University. MG werd ondersteund door postdoctorale beurzen van het Us Army Breast Cancer Program, het Ministerie van Onderzoek en Innovatie van de provincie Ontario en de Advisory Research Committee van Queen’s University. VH werd ondersteund door een CBCF doctoraatsbeurs en een postdoctorale beurs van de Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinaire Cancer Research in samenwerking met CIHR. Hanad Adan ontving een NSERC zomerstudentenschip. BS werd ondersteund door een Queen’s University graduate award.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
