Differenzierung von Mausbrustepithel-HC11- und EpH4-Zellen
Summary
Wir beschreiben Techniken zur Differenzierungsinduktion von zwei Brustepithellinien, HC11 und EpH4. Während beide fetales Kalbsserum, Insulin und Prolaktin benötigen, um Milchproteine zu produzieren, können sich EpH4-Zellen in der dreidimensionalen Kultur vollständig in Mammosphären differenzieren. Diese komplementären Modelle sind nützlich für Signaltransduktionsstudien der Differenzierung und Neoplasie.
Abstract
Cadherine spielen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Zelldifferenzierung sowie der Neoplasie. Hier beschreiben wir die Ursprünge und Methoden der Induktion der Differenzierung von zwei Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4, und ihre Verwendung zur Untersuchung komplementärer Stadien der Brustdrüsenentwicklung und neoplastischen Transformation.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie stammt aus der Brustdrüse einer schwangeren Balb/c Maus. Es unterscheidet sich, wenn es zu Zusammenfluss an einer Kunststoff-Petrischale Oberfläche in Medium mit fetalem Kalbsserum und HYdrocortison, Insulin und PRolactin (HIP-Medium) befestigt angebaut wird. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen die Milchproteine -Casein und Molkenssäureprotein (WAP), ähnlich wie laktierende Brustepithelzellen, und bilden rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die als “Dome” bezeichnet werden.
Die EpH4-Zelllinie wurde von spontan verewigten Maus-Mamma-Drüsen-Epithelzellen abgeleitet, die von einer schwangeren Balb/c-Maus isoliert wurden. Im Gegensatz zu HC11 können sich EpH4-Zellen vollständig in Sphäroide (auch Mammosphären genannt) unterscheiden, wenn sie unter dreidimensionalen (3D) Wachstumsbedingungen im HIP-Medium kultiviert werden. Die Zellen werden trypsinisiert, in einer 20%igen Matrix suspendiert, bestehend aus einer Mischung aus extrazellulären Matrixproteinen, die von Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Maussarkomzellen hergestellt werden, auf einer Schicht konzentrierter Matrixbeschichtung einer Kunststoff-Petrischale oder Multiwell-Platte plattiert und mit einer Schicht von 10% Matrix-haltigem HIP-Medium bedeckt. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen hohle Sphäroide, die eine apikal-basale Polarität aufweisen, ein hohles Lumen, und produzieren ‘-Casein und WAP.
Mit diesen Techniken zeigten unsere Ergebnisse, dass die Intensität des Cadherin/Rac-Signals für die Differenzierung von HC11-Zellen entscheidend ist. Während Rac1 für die Differenzierung und niedrige Konzentrationen der aktivierten RacV12-Erhöhung der Differenzierung notwendig ist, blockieren hohe RacV12-Spiegel die Differenzierung und induzieren Neoplasie. Im Gegensatz dazu stellen EpH4-Zellen ein früheres Stadium der Brustepitheldifferenzierung dar, das durch selbst niedrige RacV12-Spiegelgehemmt wird.
Introduction
In normalen Geweben oder Tumoren haben Zellen umfangreiche Möglichkeiten, sich in einer dreidimensionalen Organisation an ihre Nachbarn zu halten, und dies wird in der Kultur durch das Wachstum von Zellen mit hoher Dichte nachgeahmt. Die Zell-zu-Zell-Adhäsion wird hauptsächlich über Cadherinrezeptoren vermittelt, die die Zell- und Gewebearchitektur definieren. Interessanterweise wurde vor kurzem gezeigt, dass Cadherine auch eine mächtige Rolle bei der Signaltransduktion spielen, insbesondere bei der Überlebenssignalisierung1. Paradoxerweise wurden einige dieser Zell-zu-Zell-Adhäsionssignale, die von Cadherinen ausgingen, vor kurzem sowohl von der Differenzierung als auch von der Neoplasie geteilt2. Hier beschreiben wir Methoden der Induktion und Bewertung der Differenzierung in zwei repräsentativen Arten von Mausbrustepithelzelllinien, HC11 und EpH4.
Die HC11 Maus Brust epitheliale Zelllinie kann ein nützliches Modell für die Untersuchung der Epithelzelldifferenzierung bieten. HC11-Zellen sind eine VON COMMA-1D abgeleitete Zelllinie, die aus der Brustdrüse einer mittelschwangeren Balb/c-Maus3stammt. Im Gegensatz zu anderen COMMA-1D-Derivateklonen hat der HC11-Klon keine Anforderung an exogen zugesetzte extrazelluläre Matrix oder Kokultivierung mit anderen Zelltypen zur In-vitro-Induktion des endogenen -casein-Gens durch lactogene Hormone3. Diese Zelllinie wurde in Differenzierungsstudien ausgiebig verwendet, da sie wichtige Eigenschaften des normalen Brustepithels beibehalten hat: HC11-Zellen können dasduktale Epithel teilweise in einem gereinigten Brustfettpad 4 rekonstituieren. Darüber hinaus können sie in einer zweidimensionalen (2D) Kultur unterscheiden, wenn sie zu Zusammenfluss an einer Kunststoff Petri schale Oberfläche in Gegenwart eines Steroids wie HYdrocortison oder Dexamethason, zusätzlich zu Insulin und PRolactin (HIP Medium) ohne epidermale Wachstumsfaktor (EGF), ein Inhibitor der Differenzierung5,6,7. Unter diesen Bedingungen produzieren HC11-Zellen Milchproteine wie z.B. ‘-Casein und WAP, die durch Western Blotting innerhalb von 4 Tagen nach der Induktion nachweisbar sind. Gleichzeitig bildet ein Teil der HC11-Zellen rudimentäre Brustdrüsenstrukturen, die auf stochastische Weise als “Dome” bezeichnet werden. Kuppeln sind 4–5 Tage nach der Induktion sichtbar und nehmen bis zum Tag 10 allmählich zu, zusammen mit einer Erhöhung der Produktion von ‘-Casein8. Interessanterweise besitzen HC11-Zellen mutierte p539und stellen daher einen präneoplastischen Zustand dar. Aus diesem Grund eignet sich das HC11-Modell ideal, um Signalnetze der Differenzierung in Verbindung mit Neoplasie im selben Zellsystem zu untersuchen.
EpH4-Zellen, ein Derivat von IM-2-Zellen, sind eine nichttumorogene Zelllinie, die ursprünglich aus spontan verewigten Maus-Mamma-Erüsen-Epithelzellen abgeleitet wurde, die aus einer mittelschwangeren Balb/c-Maus10isoliert wurden. EpH4-Zellen bilden kontinuierliche epitheliale Monolayer in der 2D-Kultur, differenzieren sich aber nicht in drüsenähnliche Strukturen10,11. Nach dem 3D-Wachstum in einem Material, das aus einer Mischung von extrazellulären Matrixproteinen besteht, die von EHS-Maussarkomzellen12 (EHS-Matrix, Matrix oder Matrigel, siehe Tabelle der Materialien)produziert werden, können EpH4-Zellen jedoch zusätzlich zur Stimulation mit HIP die Anfangsstadien der Brustdrüsendifferenzierung rekapitulieren. Unter diesen Bedingungen bilden EpH4-Zellen Sphäroide (auch Mammosphären genannt), die eine apikal-basale Polarität und ein hohles Lumen aufweisen und in der Lage sind, die Milchproteine -Casein und WAP zu produzieren, ähnlich wie lakierende Brustepithelzellen. Im Gegensatz zu HC11-Zellen, die undifferenziert sind, und einige exprimieren mesenchymale Marker13, EpH4-Zellen zeigen eine rein luminale Morphologie14. EpH4-Zellen wurden auch berichtet, Milchproteine in 2D-Kultur durch Stimulation mit Dexamethason, Insulin und Prolaktin15zu produzieren. Dieser Ansatz schließt jedoch die Untersuchung von regulatorischen Effekten aus, die die Mikroumgebung der Brustdrüse in der 3D-Kultur imitieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
HC11-Zellen eignen sich ideal für die Untersuchung der Differenzierung in Verbindung mit neoplastischer Transformation. Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass HC11-Zellen leicht mit Mo-MLV-basierten retroviralen Vektoren infizieren können, um eine Vielzahl von Genen auszudrücken. In unseren Händen waren EpH4-Zellen schwieriger mit den gleichen retroviralen Vektoren zu infizieren als HC112.
Zell-zu-Zell-Kontakt und Wachstumsstillstand sind wichtige Voraussetzungen für …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die HC11-Zelllinie wurde freundlicherweise von Dr. D. Medina (Houston, TX) zur Verfügung gestellt. Die Autoren sind Dr. Andrew Craig von der Queen es University für viele Reagenzien und wertvolle Vorschläge dankbar. EpH4-Zellen waren ein Geschenk von Dr. C. Roskelley (UBC, Vancouver). Colleen Schick leistete hervorragende technische Unterstützung für 3D-Kulturstudien.
Finanzielle Unterstützung des Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Canadian Breast Cancer Foundation (CBCF, Ontario Chapter), der Canadian Breast Cancer Research Alliance , die Ontario Centres of Excellence, die Breast Cancer Action Kingston (BCAK) und der Clare Nelson Vermächtnisfonds durch Zuschüsse an LR werden dankbar anerkannt. BE erhielt Stipendien von CIHR, CBCF, BCAK und Cancer Research Society Inc. PTG wird von einem Canada Research Chair, der Canadian Foundation for Innovation, CIHR, NSERC und der Canadian Cancer Society unterstützt. MN wurde von einem Studentenwerk des Terry Fox Training Program in Transdisciplinary Cancer Research von NCIC, einem Graduate Award (QGA) und einem Dean es Award der Queen es University unterstützt. MG wurde durch Postdoktorandenstipendien des US Army Breast Cancer Program, des Ministry of Research and Innovation der Provinz Ontario und des Advisory Research Committee der Queen es University unterstützt. VH wurde durch ein CBCF-Doktorandenstipendium und ein Postdoktorandenstipendium des Terry Fox Foundation Training Program in Transdisciplinary Cancer Research in Partnerschaft mit CIHR unterstützt. Hanad Adan erhielt ein NSERC-Sommerstudium. BS wurde von einem Queen es University Graduate Award unterstützt.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
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