הבידול של השד העכבר האפיתל HC11 ו EpH4 תאים
Summary
אנו מתארים טכניקות לבידול אינדוקציה של שני קווי אפיתל השד, HC11 ו EpH4. בעוד ששניהם דורשים סרום עגל עוברי, אינסולין, ו פרולקטין לייצר חלבונים חלב, EpH4 תאים יכולים להבדיל באופן מלא לתוך ממוגרפיה בתרבות תלת ממדית. המודלים המשלימים הללו שימושיים למחקרים של הneoplasia בידול ומדידה.
Abstract
קדהרנס ממלאים תפקיד חשוב בוויסות בידול התא וכן בneoplasia. כאן אנו מתארים את המקורות ואת השיטות של אינדוקציה של הבידול של שני העכבר שורות האפיתל התאים, HC11 ו EpH4, ואת השימוש שלהם ללמוד בשלבים משלימים של התפתחות בלוטת החלב וטרנספורמציה נאופלסטית.
שד HC11 העכבר קו האפיתל מקורו בלוטת החלב של עכבר Balb/c בהריון. זה מבדיל כאשר גדל למפגש מחובר משטח צלחת פטרי פלסטיק בינוני המכיל סרום עגל עוברי ו- Hydrocortisone, אניNsulin ו PROLACTIN (מדיום היפ). בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר את החלבונים בחלב β-קזאין, חלבון חומצי מי גבינה (WAP), בדומה לתאי הנקה המניקה התאים, וצורות בלוטת החלב בצורת בלוטה הנקרא “כיפות”.
קו התא EpH4 נגזר באופן ספונטני בלוטת החלב של העכבר תאים אפיתל מבודדים מעכבר Balb/c בהריון. שלא כמו HC11, תאים EpH4 יכולים להבדיל באופן מלא לתוך spheroids (המכונה גם ממוגרפיה) כאשר התרבות תחת תלת מימדי (3D) תנאי גדילה במדיום HIP. תאים הם טריסינטזציה, התלויה ב 20% מטריצה המורכבת מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי אנגלברב-הולם-נחיל (EHS) עכבר בתאי סרקומה, מצופה על גבי שכבה של ציפוי מטריצה מרוכזת צלחת פטרי או צלחת multiwell יטב, מכוסה בשכבה של 10% מטריקס מכיל מדיום הירך. בתנאים אלה, תאי EpH4 מהווים מספרואידים חלולים המוצגים קוטביות-בסיס, לומן חלול, ומייצרים β-קזאין ו-WAP.
באמצעות טכניקות אלו, התוצאות שלנו הראו כי עוצמת האות של קדהרין/מירוץ היא קריטית עבור הבידול של תאים HC11. בעוד Rac1 הוא הכרחי עבור בידול ורמות נמוכות של מירוץ המופעלרובוטית v12 להגדיל את הבידול, מירוץ גבוהרובוטית v12 רמות לחסום בידול תוך גרימת neoplasia. לעומת זאת, תאי EpH4 מייצגים שלב מוקדם יותר בידול האפיתל הפטמות, אשר מעוכב על ידי רמות נמוכות אפילו שלמרובוטית v12מירוץ.
Introduction
ברקמות רגילות או גידולים, לתאים יש הזדמנויות נרחבות הדבקה לשכניהם בארגון תלת מימדי, וזה מחקה בתרבות על ידי צמיחת תאים בצפיפות גבוהה. הדבקה תא לתא מתווכת בעיקר באמצעות קולטני קדהרין, המגדירים את ארכיטקטורת התאים והרקמה. מעניין, זה הוכיח לאחרונה כי cadherins גם לשחק תפקיד רב עוצמה התמרה האות, במיוחד הישרדות איתות1. אופן פרדוקסאלי, חלק האותות האלה תא לתא הדבקה הנובע cadherins נמצאו לאחרונה להיות משותפים על ידי בידול וגם neoplasia2. כאן, אנו מתארים שיטות של אינדוקציה והערכה של בידול שני סוגים של הנציג של שד העכבר האפיתל קווים, HC11 ו EpH4.
שד HC11 העכבר האפיתל קו התאים יכול לספק מודל שימושי למחקר של בידול התא אפיתל. תאי HC11 הם קו שנגזר באמצעות פסיקים-1D, שמקורם בבלוטת החלב של עכבר באמצע ההיריון בגודל Balb/c3. בניגוד אחרים פסיקים-1D שיבוטים נגזרים, HC11 שיבוט אין דרישה לשימוש באופן אקסוגנטי מטריצה מוסף או טיפוח עם סוגי תאים אחרים עבור האינדוקציה מחוץ לשני של הגן האנדוגניים β-קזאין על ידי הורמונים lactogenic3. קו תא זה נעשה שימוש נרחב במחקרים בידול כי הוא שמרו מאפיינים חשובים של אפיתל הפטמות נורמלי: HC11 תאים יכול באופן חלקי ליצור מחדש את האפיתל ductal בתוך משטח שומן החלב העבה4. יתר על כן, הם יכולים להבדיל בתרבות דו-ממדית (2d) כאשר גדל למפגש המצורפת משטח צלחת פטרי פלסטיק בנוכחות של סטרואידים כגון Hydrocortisone או דקאמתאסone, בנוסף אניnsulin ו Prolactin (היפ בינוני) חסר גורם גידול עוריות (egf), מעכב של בידול5,6,7. בתנאים אלה, תאי HC11 לייצר חלבונים חלב כגון β-קזאין ו-WAP, אשר מ על ידי בלוק המערבי בתוך 4 ימים לאחר האינדוקציה. באותו זמן, חלק של תאים HC11 צורות בלוטת הפטמות בצורת בלוטה הנקרא “כיפות” באופן סטוכסטי. כיפות גלויות 4 – 5 ימים לאחר האינדוקציה ולהגדיל בהדרגה בגודל של עד היום 10, במקביל עם גידול בייצור β-קזאין8. מעניין, HC11 תאים בעלי מוטציה p539, ולכן מייצגים מדינה preneoplastic. מסיבה זו, המודל HC11 מתאים באופן אידיאלי כדי לחקור רשתות איתות של בידול בשילוב עם neoplasia באותה מערכת התא.
EpH4 תאים, נגזרת של התאים IM-2, הם קו תא התאים המקורי נגזר במקור באופן ספונטני בלוטת החלב העכבר תאים אפיתל בודד מ באמצע בהריון Balb/c העכבר10. תאים EpH4 טופס אפיתל מונאולאיירס בתרבות 2D, אבל לא להבדיל לתוךמבנים כמו בלוטות 10,11. עם זאת, בעקבות צמיחה תלת-ממדית בחומר המורכב מתערובת של חלבונים מטריצות של מטריקס המיוצר על ידי תאים EHS העכבר סרקומה12 (EHS מטריקס, מטריקס, או מטריצות, ראה טבלה של חומרים), בנוסף גירוי עם היפ, EpH4 תאים יכול ללכוד את השלבים הראשוניים של בלוטת החלב בידול. בתנאים אלה, תאי הEpH4 היוצרים בצורת הספרואידים (המכונים גם ממוגרפיה) המוצגים קוטביות-בסיס ולומן חלול, ומסוגלים לייצר את חלבוני החלב הβ-קזאין ו-WAP, בדומה לתאי האפיתל מניקות. בניגוד HC11 תאים, אשר מובחן, וכמה סמנים mesenchymal מהיר13, תאים EpH4 להציג מורפולוגיה גרידא הלומיאל14. תאים EpH4 גם דיווחו לייצר חלבונים חלב בתרבות דו-ממדית באמצעות גירוי עם דקאמתאס1, אינסולין, ו פרולקטין15. עם זאת, גישה זו מונע את המחקר של השפעות רגולטוריות המחקים את מיקרואקולוגיה של בלוטת החלב בתרבות תלת-ממדית.
Protocol
Representative Results
Discussion
התאים הHC11 מתאימים באופן אידיאלי לחקר הבידול בשילוב עם טרנספורמציה נאופלסטית. יתרון נוסף הוא כי תאים HC11 הם בקלות infectable עם מו-MLV מבוססי וקטורים retroviral יעיל לבטא מגוון של גנים. בידינו, תאים EpH4 היו קשים יותר להדביק עם אותו וקטורים retroviral יעיל מאשר HC112.
מגע מתאים לתאים ו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קו התא HC11 המסופק באדיבות ד ר ד. מדינה (יוסטון, TX). המחברים אסירי תודה ד ר אנדרו קרייג מאוניברסיטת המלכה עבור הצעות רבות של ריאגנטים ובעלי ערך. תאי EpH4 היו מתנה מדר ‘ ר. רוסקללי (ונקובר). קולין Schick סיפק סיוע טכני מעולה ללימודי תרבות תלת-ממדית.
הסיוע הכספי של מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), המכונים הקנדיים של מחקר הבריאות (CIHR), הקרן הקנדית לסרטן השד (CBCF, אונטריו פרק), סרטן השד הקנדי הברית המחקר , מרכזי אונטריו של מצוינות, סרטן השד פעולה קינגסטון (BCAK) ואת הקרן קלייר נלסון עיזבון באמצעות מענקים LR הוא הודה בהכרת. להיות מקבל תמיכה מענקים CIHR, CBCF, BCAK האגודה לחקר הסרטן Inc. PTG נתמך על ידי יו ר מחקר קנדה, הקרן הקנדית לחדשנות, CIHR, NSERC והחברה הקנדית הסרטן. MN נתמך על ידי הספינה מתוך תוכנית ההכשרה טרי פוקס במחקר טרנסמשמעתי סרטן מ-NCIC, בוגר פרס (QGA), ופרס של דיקן מאוניברסיטת המלכה. ה-MG נתמך על ידי מלגות דוקטורט מתוכנית סרטן השד בארה ב, משרד המחקר והחדשנות של מחוז אונטריו וועדת המחקר המייעצת של אוניברסיטת המלכה. VH נתמך על ידי מלגת דוקטורט של CBCF ומלגת דוקטורט מתוכנית ההכשרה של קרן טרי פוקס בחקר הסרטן הטרנסמשמעתי בשותפות עם CIHR. Hanad אדן היה המקבל של הקיץ NSERC הסירה. BS הייתה נתמכת בתואר בוגר אוניברסיטת המלכה.
Materials
| 30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
| Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
| Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
| Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
| Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
| Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
| Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
| Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
| Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
| DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
| Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
| EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
| Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
| Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
| Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
| Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
| Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
| Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
| insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
| Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
| Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
| Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
| Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
| Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
| Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
| Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
| NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
| NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
| Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
| Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
| NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
| Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
| Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
| pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
| Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
| Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
| Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
| Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
| Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
| Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
| Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
| Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |
References
- Geletu, M., Guy, S., Arulanandam, R., Feracci, H., Raptis, L. Engaged for survival; from cadherin ligation to Stat3 activation. Jaks-Stat. 2, 27363-27368 (2013).
- Niit, M., et al. Regulation of HC11 mouse breast epithelial cell differentiation by the E-cadherin/Rac axis. Experimental Cell Research. 361 (1), 112-125 (2017).
- Ball, R. K., Friis, R. R., Schoenenberger, C. A., Doppler, W., Groner, B. Prolactin regulation of beta-casein gene expression and of a cytosolic 120-kd protein in a cloned mouse mammary epithelial cell line. The EMBO Journal. 7 (7), 2089-2095 (1988).
- Humphreys, R. C., Rosen, J. M. Stably transfected HC11 cells provide an in vitro and in vivo model system for studying Wnt gene function. Cell growth & differentiation. 8 (8), 839-849 (1997).
- Merlo, G. R., et al. differentiation and survival of HC11 mammary epithelial cells: diverse effects of receptor tyrosine kinase-activating peptide growth factors. European Journal of Cell Biology. 70 (2), 97-105 (1996).
- Wirl, G., Hermann, M., Ekblom, P., Fassler, R. Mammary epithelial cell differentiation in vitro is regulated by an interplay of EGF action and tenascin-C downregulation. Journal of Cell Science. 108, 2445-2456 (1995).
- Arbeithuber, B., et al. Aquaporin 5 expression in mouse mammary gland cells is not driven by promoter methylation. BioMed Research International. 2015, 460598 (2015).
- Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. Journal of Visualized Experiments. (32), e1265 (2009).
- Merlo, G. R., et al. Growth suppression of normal mammary epithelial cells by wild-type p53. Oncogene. 9, 443-453 (1994).
- Reichmann, E., Ball, R., Groner, B., Friis, R. R. New mammary epithelial and fibroblastic cell clones in coculture form structures competent to differentiate functionally. Journal of Cell Biology. 108 (3), 1127-1138 (1989).
- Somasiri, A., Wu, C., Ellchuk, T., Turley, S., Roskelley, C. D. Phosphatidylinositol 3-kinase is required for adherens junction-dependent mammary epithelial cell spheroid formation. Differentiation. 66 (2-3), 116-125 (2000).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods in Molecular Biology. 945, 221-250 (2013).
- Williams, C., Helguero, L., Edvardsson, K., Haldosen, L. A., Gustafsson, J. A. Gene expression in murine mammary epithelial stem cell-like cells shows similarities to human breast cancer gene expression. Breast Cancer Research. 11 (3), 26 (2009).
- Montesano, R., Soriano, J. V., Fialka, I., Orci, L. Isolation of EpH4 mammary epithelial cell subpopulations which differ in their morphogenetic properties. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 34 (6), 468-477 (1998).
- Nagaoka, K., Zhang, H., Watanabe, G., Taya, K. Epithelial cell differentiation regulated by MicroRNA-200a in mammary glands. PLoS One. 8 (6), 65127 (2013).
- Arulanandam, R., et al. Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3. Molecular Cancer Research. 17, 1310-1327 (2009).
- Geletu, M., et al. Classical cadherins control survival through the gp130/Stat3 axis. BBA-Molecular Cell Research. 1833, 1947-1959 (2013).
- Raptis, L., Arulanandam, R., Geletu, M., Turkson, J. The R(h)oads to Stat3: Stat3 activation by the Rho GTPases. Experimental Cell Research. 317 (13), 1787-1795 (2011).
- Raptis, L., et al. Beyond structure, to survival: Stat3 activation by cadherin engagement. Biochemistry and Cell Biology. 87, 835-843 (2009).
- Niit, M., et al. Regulation of Differentiation of HC11 Mouse Breast Epithelial Cells by the Signal Transducer and Activator of Transcription-3. Anticancer Research. 39 (6), 2749-2756 (2019).
- Brinkmann, V., Foroutan, H., Sachs, M., Weidner, K. M., Birchmeier, W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. Journal of Cell Biology. 131, 1573-1586 (1995).
- Starova, B. . Role of cell adhesion microevironment and the Src/Stat3 axis in autocrine HGF signaling during breast tumourigenesis. , (2008).
- Raptis, L., et al. Rasleu61 blocks differentiation of transformable 3T3 L1 and C3HT1/2-derived preadipocytes in a dose- and time-dependent manner. Cell Growth & Differentiation. 8, 11-21 (1997).
- Greer, S., Honeywell, R., Geletu, M., Arulanandam, R., Raptis, L. Housekeeping gene products; levels may change with confluence of cultured cells. Journal of Immunological Methods. 355, 76-79 (2010).
- Vultur, A., et al. Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells. Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Hoskin, V. C. . A novel regulatory role of Ezrin in promoting breast cancer cell invasion and metastasis. , (2015).
- Su, H. W., et al. Cell confluence-induced activation of signal transducer and activator of transcription-3 (Stat3) triggers epithelial dome formation via augmentation of sodium hydrogen exchanger-3 (NHE3) expression. Journal of Biological Chemistry. 282 (13), 9883-9894 (2007).
- Ostrovidov, S., et al. Skeletal muscle tissue engineering: methods to form skeletal myotubes and their applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (5), 403-436 (2014).
- Cass, J. . Novel Stat3 and Stat5 pathways in epithelial cell differentiation. , (2013).
