Мы описываем методы индукции двух эпителиальных линий молочной железы, HC11 и EpH4. В то время как оба требуют сыворотки плода теленка, инсулина и пролактина для производства молочных белков, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в маммосферы в трехмерной культуре. Эти дополнительные модели полезны для исследований трансдукции сигналов дифференциации и неоплазии.
Кадхерины играют важную роль в регулировании дифференциации клеток, а также неоплазии. Здесь мы описываем происхождение и методы индукции дифференциации двух линий эпителиальной клеточной клетки молочной железы, HC11 и EpH4, а также их использование для изучения дополнительных этапов развития молочной железы и неопластической трансформации.
Линия эпителиальной клеточной клетки мышки HC11 возникла из молочной железы беременной мыши Balb/c. Он дифференцируется, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности чашки Петри в среде, содержащей сыворотки икроножной железы плода и Hydrocortisone, Insulin и Prolactin (HIP среды). В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки и сывороточный кислотный белок (WAP), похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы, и образуют рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами».
Линия клеток EpH4 была получена из спонтанно увековеченных мышей молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от беременной бальзам / c мыши. В отличие от HC11, клетки EpH4 могут полностью дифференцироваться в сфероиды (также называемые маммосферы), когда культивируется в трехмерных (3D) условиях роста в среде HIP. Клетки трипсинизированы, подвешены в 20% матрице, состоящей из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), покрынные поверх слоя концентрированной матрицы, покрывающей пластиковую тарелку Петри или многоцветную пластину, и покрытые слоем 10% матрицы, содержащей HIP среду. В этих условиях клетки EpH4 образуют полые сфероиды, которые демонстрируют апикально-базальную полярность, полый просвет, и производят к-казеин и WAP.
Используя эти методы, наши результаты показали, что интенсивность сигнала cadherin/Rac имеет решающее значение для дифференциации клеток HC11. В то время как Rac1 необходим для дифференциации и низких уровней активированного RacV12 увеличить дифференциацию, высокие уровни RacV12 блокируют дифференциацию, вызывая неоплазию. В отличие от этого, клетки EpH4 представляют собой более раннюю стадию в дифференциации эпителии молочной железы, которая тормозится даже низким уровнем RacV12.
В нормальных тканях или опухолях клетки имеют широкие возможности для примыкания к своим соседям в трехмерной организации, и это передразняется в культуре высоким ростом клеток плотности. Клеточная стежка опосредована главным образом через рецепторы кадерин, которые определяют архитектуру клеток и тканей. Интересно, что недавно было продемонстрировано, что кадерины также играют важную роль в трансдукции сигналов, особенно в выживании сигнализации1. Парадоксально, но некоторые из этих клеточных стыковочных сигналов, исследующих из кадерин, были недавно найдены общими как дифференциации и неоплазии2. Здесь мы описываем методы индукции и оценки дифференциации в двух представительных типах эпителиальных клеточных линий молочной железы мыши, HC11 и EpH4.
Линия эпителиальной клеточной линии мыши HC11 может стать полезной моделью для изучения дифференциации эпителиальных клеток. Клетки HC11 являются comMA-1D-производные клеточной линии, происходящих из молочной железы в середине беременной Balb / c мыши3. В отличие от других производных клонов COMMA-1D, клон HC11 не требует экзогенно добавленной внеклеточной матрицы или кокультивации с другими типами клеток для индукции в пробирке эндогенного гена эндогенного гена лактогенными гормонами3. Эта клеточная линия была широко использована в исследованиях дифференциации, потому что она сохранила важные характеристики нормального эпителия молочной железы: клетки HC11 могут частично воссоздать протоковый эпителий в очищенной молочной жирной площадке4. Кроме того, они могут дифференцировать в двумерной (2D) культуры, когда выросли до слияния прилагается к пластиковой поверхности блюда Петри в присутствии стероидов,таких как Hydrocortisone или Дексаметазон, в дополнение к Insulin и Prolactin (HIP средний) не хватает эпидермального фактора роста (EGF), ингибитор дифференциации5,6. В этих условиях клетки HC11 производят молочные белки, такие как к-казеин и WAP, которые обнаруживаются западными промотированием в течение 4 дней после индукции. В то же время, часть клеток HC11 образует рудиментарные молочные железоподобные структуры, называемые «куполами» в стохастической манере. Куполы видны через 4-5 дней после индукции и постепенно увеличиваются в размерах до 10-го дня, что сопутствует увеличению производства к-казеина8. Интересно, что клетки HC11 обладают мутантом p539,и поэтому представляют собой преднеопластическое состояние. По этой причине модель HC11 идеально подходит для изучения сигнальных сетей дифференциации в сочетании с неоплатой в одной и той же клеточной системе.
Клетки EpH4, производные im-2 клеток, являются неопухолевой клеточной линии первоначально полученных от спонтанно увековеченных мыши молочной железы эпителиальных клеток, изолированных от середины беременности Balb / C мыши10. Клетки EpH4 образуют непрерывные эпителиальные монослои в 2D-культуре, но не дифференцируются в железоподобные структуры10,11. Однако, после 3D роста в материале, состоящем из смеси внеклеточных матричных белков, производимых клетками саркомы мыши EHS12 (EHS matrix, matrix, или Matrigel, см. Таблица Материалов),в дополнение к стимуляции с HIP, epH4 клетки могут резюмировать начальные стадии дифференциации молочной железы. В этих условиях клетки EpH4 образуют сфероиды (также называемые маммосферами), которые демонстрируют апикально-базальную полярность и полый просвет, и способны производить молочные белки и WAP, похожие на лактирующие эпителиальные клетки молочной железы. В отличие от клеток HC11, которые являются недифференцированными, а некоторые выражают мезенхимальные маркеры13,клетки EpH4 демонстрируют чисто светлую морфологию14. EpH4 клетки также сообщалось производить молочные белки в 2D культуры путем стимуляции с дексаметазоном, инсулином и пролактином15. Однако такой подход исключает изучение регулятивных эффектов, имитирующих микросреду молочной железы в 3D-культуре.
Клетки HC11 идеально подходят для изучения дифференциации в сочетании с неопластической трансформацией. Дополнительным преимуществом является то, что клетки HC11 легко заражаются ретровирусными вектором на основе Mo-MLV для выражения различных генов. В наших руках клетки EpH4 было труднее за…
The authors have nothing to disclose.
Линия клеток HC11 была любезно предоставлена доктором Д. Мединой (Хьюстон, Техас). Авторы благодарны доктору Эндрю Крейгу из Королевского университета за множество реагентов и ценных предложений. Клетки EpH4 были подарком от доктора C. Roskelley (UBC, Ванкувер). Коллин Шик оказала отличную техническую помощь для 3D-культуры исследований.
Финансовая помощь Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC), Канадских институтов исследований в области здравоохранения (CIHR), Канадского фонда рака молочной железы (CBCF, Онтарио Глава), Канадского альянса исследований рака молочной железы , Онтарио Центры передового опыта, рака молочной железы действий Кингстон (BCAK) и Клэр Нельсон завещание фонда через гранты LR с благодарностью признается. BE получил грантовую поддержку от CIHR, CBCF, BCAK и онкологических исследований общества Инк PTG поддерживается Канады научно-исследовательский председатель, Канадский фонд инноваций, CIHR, NSERC и Канадского онкологического общества. MN была поддержана студентом из Терри Фокс Учебная программа в transdisciplinary исследований рака от NCIC, Высшей премии (ЗГА), и премия декана от Университета королевы. MG была поддержана постдокторской стипендий от армии США рака молочной железы программы, Министерство исследований и инноваций провинции Онтарио и Консультативный исследовательский комитет Королевского университета. VH была поддержана докторской стипендией CBCF и постдокторской стипендией от Программы обучения Фонда Терри Фокса в области трансдисциплинарных онкологических исследований в партнерстве с CIHR. Ханад Адан был получателем летнего обучения NSERC. BS была поддержана наградой выпускника Королевского университета.
30% Acrylamide/0.8% Bis Solution | Bio Rad | 1610154 | Western Blotting |
Anti-Cyclin D1 antibody | rabbit, Santa Cruz | sc-717 | Western Blotting |
Anti-p120 antibody | mouse, Santa Cruz | sc-373751 | Western Blotting |
Anti-β actin antibody | mouse, Cell Signalling technology | 3700 | Western Blotting |
Anti-β casein antibody | goat, Santa Cruz Biotechnology | sc-17971 | Western Blotting |
Aprotinin | Bio Shop | APR600 | Lysis Buffer |
Bicinchoninic Acid Solution | Sigma | B9643-1L-KC | Protein Determination |
Bovine serum albumin | Bio Shop | ALB007.500 | Protein Determination |
Clarity Western ECL Substrate | Bio Rad | 170-5061 | Western Blotting |
Copper(II) sulphate | Sigma | C2284-25ML | Protein Determination |
DAPI | Thermofisher Scientific | D1306 | Staining |
Digitonin | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 14952-500 | Staining |
EDTA | Bio Shop | EDT001.500 | |
Epidermal Growth Factor | Sigma | E9644 | Medium for HC11 Cells |
Fetal calf serum | PAA | A15-751 | Cell Culture Medium |
Goat- Anti Rabbit-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | Western Blotting |
Hepatocyte Growth Factor recombinant | Gibco | PHG0321 | |
Hepes | Sigma | 7365-45-9 | Cell Culture |
Horse Anti-Mouse HRP | Cell Signalling Technology | 7076 | Western Blotting |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | HIP Medium |
insulin | Sigma | I6634 | HIP Medium |
Laminar-flow hood | BioGard Hood | Cell Culture | |
Leupeptin | Bio Shop | LEU001.10 | Lysis Buffer |
Matrix (Engelbreth-Holm-Swarm matrix, Matrigel) | Corning | CACB 354230 | |
Mouse Anti-Goat HRP | Santa Cruz | sc-8360 | Western Blotting |
Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem, Cedarlane Laboratories Ltd | 475904-100GM | Staining |
Multi-photon confocal microscope | Leica TCS SP2 | ||
Na3VO4 | Bio Shop | SOV850 | Lysis Buffer |
Na4P207 | Sigma | 125F-0262 | Lysis Buffer |
NaCl | Bio Shop | SOD001.1 | Western Blotting |
NaF | Fisher Scientific | 7681-49-4 | Lysis Buffer |
Nikon digital Camera | Coolpix 995 | ||
Nitrocellulose | Bio Rad | 1620112 | Western Blotting |
NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 30525-89-4 | Staining |
Phase Contrast Microscope | Olympus IX70 | Cell Culture | |
Phenylmethylsuphonyl fluoride | Sigma | 329-98-6 | Lysis Buffer |
pMX GFP Rac G12V | Addgene | 14567 | |
Prolactin | Sigma | L6520 | HIP Medium |
RPMI-1640 | Sigma | R8758 | Cell Culture Medium |
Tissue Culture Dish 35 | Sarstedt | 83.3900. | Cell Culture |
Tissue Culture Plate-24 well | Sarstedt | 83.1836.300 | Cell Culture |
Transfer Apparatus | CBS Scientific Co | EBU-302 | Western Blotting |
Tris Acetate | Bio Shop | TRA222.500 | Western Blotting |
Trypsin | Sigma | 9002-07-7. | Cell Culture |
Tween-20 | Bio Shop | TWN510.500 | Western Blotting |
Veritical Gel Electrophoresis System | CBS Scientific Co | MGV-202-33 | Western Blotting |