Este manuscrito describe un protocolo para determinar si la exposición al ozono, un criterio contaminante del aire, afecta a la eferocítosis in vivo de los macrófagos alveolares. Este protocolo utiliza reactivos y técnicas de uso común y se puede adaptar a múltiples modelos de lesión pulmonar para determinar los efectos sobre la eferocittosis de macrófagos alveolares.
El ozono (O3)es un contaminante del aire criterio que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas. Se sabe que la exposición a O3 induce inflamación pulmonar, pero se sabe poco con respecto a cómo la exposición altera los procesos importantes para la resolución de la inflamación. La efferocitasis es un proceso de resolución, mediante el que los macrófagos fagocytizan las células apoptóticas. El propósito de este protocolo es medir la eferocitis de los macrófagos alveolares después de la lesión pulmonar inducida por O3y la inflamación. Se han descrito varios métodos para medir la eferocitosis; sin embargo, la mayoría requieren manipulaciones ex vivo. Aquí se describe en detalle un protocolo para medir la efistosis de macrófagos alveolares in vivo 24 h después de la exposición a O3, que evita la manipulación ex vivo de los macrófagos y sirve como una técnica simple que se puede utilizar para perturbar con precisión las representaciones en este proceso de resolución. El protocolo es un método técnicamente no intensivo y relativamente barato que implica inhalación de O3 de todo el cuerpo seguida de la aspiración orofaríngea de células apoptóticas (es decir, células T Jurkat) mientras está bajo anestesia general. La eferocitosis de macrófagos alveolares se mide entonces mediante la evaluación por microscopía de luz de macrófagos recogidos del lavado broncoalveolar (BAL). La eferocítis finalmente se mide calculando un índice efferocítico. Colectivamente, los métodos descritos cuantifican la actividad efferocí en el pulmón in vivo mientras que también sirven para analizar los efectos negativos para la salud de O3 u otros insultos inhalados.
El pulmón está constantemente expuesto a insultos ambientales, incluyendo partículas de aire, virus, bacterias y gases oxidantes que desencadenan inflamación pulmonar1,2,3. Estos insultos pueden comprometer el intercambio de gas e inducir lesiones de tejidoirreversibles 4,5. Los macrófagos alveolares, que constituyen aproximadamente el 95% de las células inmunitarias que se encuentran en los pulmones murinos y humanos en la homeostasis, son reguladores críticos de la inflamación pulmonar después de los insultos ambientales1,2, 3,4,5. Los macrófagos alveolares son esenciales durante la defensa del huésped al fagocica y eliminando patógenos. Recientemente, se ha demostrado que los macrófagos alveolares promueven la homeostasis tisular y la resolución de la inflamación a través de la eferocitosis6,7. La efferocitasis es un proceso fagocítico en el que los macrófagos envuelven y eliminan las células apoptóticas8,9,10. La eferocitosis también da lugar a la producción de mediadores (es decir, IL-10, TGF-, PGE2y óxido nítrico) que aumentan aún más el proceso, lo que resulta en la resolución de la inflamación9,10,11 ,12,16,18. Este proceso es necesario para prevenir la necrosis secundaria y promover la homeostasis tisular12,13,14. Varios estudios han relacionado la insuficiencia efefitosis con diversas enfermedades pulmonares crónicas, incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y fibrosis pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.
O3 es un criterio contaminante del aire que exacerba y aumenta la incidencia de enfermedades pulmonares crónicas19,20,21. O3 induce inflamación pulmonar y lesión y se sabe que afecta la fagocitosis de los patógenos bacterianos22,23. Sin embargo, se desconoce si O3 afecta a la eferocitosis de macrófagos alveolares. La investigación de alteraciones inducidas por O3en la eferocitais de macrófagos alveolares proporcionará una visión potencial de cómo la exposición puede conducir a la incidencia y exacerbación de enfermedades pulmonares crónicas. A continuación se describe un método sencillo para evaluar la eferocítosis de macrófagos alveolares en los pulmones de ratones hembras después de la exposición aguda a O3.
El método esbozado posee varias ventajas sobre otros protocolos de efferocittosis comúnmente utilizados en el campo al eliminar el uso de costosos colorantes fluorescentes, mediciones extensas de citometría de flujo y manipulación ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Además, este protocolo mide la eferocítis de macrófagos alveolares en el contexto del microambiente pulmonar, que puede influir en la función de los macrófagos.
La eferocitosis es un proceso antiinflamatorio en el que los macrófagos limpian las células apoptoticas y los desechos, así como producen múltiples mediadores antiinflamatorios9,10,11,12,16 ,18. Múltiples modelos de efferocittosis han proporcionado información sobre cómo el macrófago es una célula crítica en la res…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio está financiado por el Instituto de Efectos para la Salud Walter A. Rosenblith Award y NIEHS R01ES028829 (a K. M. G). Nos gustaría dar las gracias a la Dra. Dianne Walters (Departamento de Fisiología, ECU) por su ayuda para obtener imágenes representativas de los macrófagos alveolares.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |