כתב יד זה מתאר פרוטוקול לקביעת האם חשיפה לאוזון, קריטריון מזהם אוויר, פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis בvivo. פרוטוקול זה מנצל בדרך כלל ריאגנטים וטכניקות והוא יכול להיות מותאם מודלים מרובים של פגיעה בריאות כדי לקבוע את ההשפעות על מכתשי מקרופאג efferocytosis.
אוזון (O3) הוא קריטריון מזהם אוויר המגדילה ומגביר את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות. O3 חשיפה ידוע לגרום לדלקת בריאות, אבל מעט ידוע לגבי איך חשיפה משנה תהליכים חשובים הרזולוציה של דלקת. Efferocytosis הוא תהליך החלטה, לפיו מקרופאגים מפאגים בתאי האפוטוטיים. המטרה של פרוטוקול זה היא למדוד מכתשי מקרופאג efferocytosis בעקבות המושרה הנגרמת פציעה ריאה ודלקת. מספר שיטות תוארו עבור מדידת efferocytosis; עם זאת, רוב דורשים מניפולציות vivo ex. מתוארים בפירוט כאן הוא פרוטוקול למדוד vivo מכתשי מקרופאג efferocytosis 24 שעות אחרי החשיפה O3 , אשר נמנעת מניפולציה vivo ex של מקרופאגים ומשמש כטכניקה פשוטה שניתן להשתמש בו כדי לייצג במדויק רטבאליות תהליך החלטה זה. הפרוטוקול הוא שיטה מבחינה טכנית שאינה אינטנסיבית וזולה יחסית המערבת שאיפת גוף שלם3 ולאחריה שאיפה לוע של תאים אפוטוטיים (כלומר, התאים של ג’ורקאט T) תוך כדי הרדמה כללית. מכתשיים מקרופאג efferocytosis נמדד לאחר מכן על ידי הערכת מיקרוסקופ אור של מקרופאגים שנאספו מתוך ברונשיים (BAL) ששטיפה. Efferocytosis נמדד לבסוף על-ידי חישוב אינדקס efferocytic. באופן קולקטיבי, שיטות מיתאר לכמת פעילות efferocytic בריאה ב vivo תוך שהיא משרתת גם לנתח את ההשפעות הבריאותיות השליליות של O3 או עלבונות אחרים שאפו.
הריאה נחשפת כל הזמן לעלבונות סביבתיים, כולל חלקיקים אוויריים, וירוסים, חיידקים, וגזים חמצון המפעילות דלקת ריאות1,2,3. העלבונות האלה יכולים להתפשר על החלפת גזולגרום לפציעה הרקמהבלתי הפיכה 4,5. מכתשי מקרופאגים, המהווים כ 95% של התאים החיסוניים נמצא מורנה והריאות האנושית ב הומאוסטזיס, הם הרגולטורים קריטיים של דלקת ריאות לאחר עלבונות סביבתיים1,2, .שלוש,ארבע,חמש מקרופאגים מכתשיים חיוניים במהלך ההגנה המארחת על ידי phagocytizing וסילוק פתוגנים. לאחרונה, מכתשי מקרופאגים הוכחו לקדם את הומאוסטזיס רקמות ואת הרזולוציה של דלקת דרך efferocytosis6,7. Efferocytosis הוא תהליך phagocytic שבו מקרופאגים המפרץ לחסל תאים אפוטוטיים8,9,10. Efferocytosis גם תוצאות ייצור של מגשרים (כלומר, IL-10, tgf-β, pge2, ו תחמוצת החנקן) כי עוד להגדיל את התהליך, וכתוצאה מכך הרזולוציה של דלקת9,10,11 ,12,16,18. תהליך זה הכרחי למניעת נמק משני וקידום הומאוסטזיס הרקמות12,13,14. מספר מחקרים המקושרים efferocytosis לקוי עם מחלות ריאה כרוניות שונות, כולל אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ו פיברוזיס ריאות אידיופטית8,9,15, 16,17.
O3 הוא קריטריון מזהם אוויר כי מגביר בייטס ומגדיל את השכיחות של מחלות ריאות כרוניות19,20,21. O3 מעורר דלקת הריאות פציעה והוא ידוע לפגוע מכתשי מקרופאג phagocyציטוזה של פתוגנים חיידקיים22,23. עם זאת, זה לא ידוע אם3 או 2 פוגע מכתשי מקרופאג efferocytosis. חקירת O3שינויים המושרה ב מכתשי מקרופאג efferocytosis יספק תובנה פוטנציאלית לתוך כמה חשיפה יכולה להוביל לשכיחות מחלת הריאות כרונית והחרפה. המתואר להלן היא שיטה פשוטה להערכת מכתשי מקרופאג efferocytosis בריאות של עכברים נקבה לאחר החשיפה החדה O3 .
השיטה מחולקת על מספר יתרונות על פני פרוטוקולים efferocytosis אחרים בשימוש נפוץ בתחום על-ידי ביטול השימוש של צבעי פלורסנט יקר, מדידות הזרימה הנרחבת cy, ולשעבר vivo מניפולציה של מכתשי מקרופאגים24 ,25. בנוסף, פרוטוקול זה מודד מכתשיים מקרופאג efferocytosis בהקשר של מיקרו הסביבה הריאה, אשר יכול להשפיע על מקרופאג פונקציה.
Efferocytosis הוא תהליך אנטי דלקתי שבו מקרופאגים ברורים תאים ופסולת ברור כמו גם לייצר מגשרים אנטי דלקתיות מרובים9,10,11,12,16 ,18. מודלים מרובים של efferocytosis סיפקו תובנה כיצד מקרופאג הוא תא קריטי…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה ממומן על ידי המכון לאפקטים בריאותיים וולטר א. רוזנבליט ו-הR01ES028829 (ק. מ. ג). אנו רוצים להודות לד ר דיאן וולטרס (המחלקה לפיזיולוגיה, ECU) על עזרתה בהשגת תמונות מייצגות של מקרופאגים מכתשיים.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |