Данная рукопись описывает протокол для определения того, является ли воздействие озона, критерия загрязнителя воздуха, ухудшает альвеолярный макрофаг энеррозитоз in vivo. Этот протокол использует широко используемые реагенты и методы и может быть адаптирован к нескольким моделям легочной травмы, чтобы определить влияние на альвеолярный макрофage эпрероцитоз.
Озон (O3) является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями. O3 воздействия, как известно, вызывают воспаление легких, но мало известно о том, как воздействие изменяет процессы, важные для разрешения воспаления. Эффероцитоз является процесс разрешения, в котором макрофаги фагоцитации апоптотические клетки. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы измерить альвеолярный макрофаг эпрероцитоз после O3индуцированной травмы легких и воспаления. Было описано несколько методов измерения эффоцитоза; однако, большинство из них требуют манипуляций ex vivo. Описано в деталях здесь протокол для измерения в vivo альвеолярный макрофage efferocytosis 24 ч после O3 воздействия, который избегает ex vivo манипуляции макрофагов и служит простой метод, который может быть использован для точного представления возмущений в этот процесс разрешения. Протокол является технически неинтенсивным и относительно недорогим методом, который включает в себя ингаляцию всего тела O3 с последующим аспириальным аспирированием апоптотических клеток (т.е. юркат Т-клеток) в то время как под общим наркозом. Альвеолярный макрофage efferocytosis затем измеряется световой микроскопии оценки макрофагов, собранных из бронхоальвеолярной (BAL) лаважа. Эффероцитоз, наконец, измеряется путем расчета энемероцитарного индекса. В совокупности, изложенные методы количественно эвэроцитической активности в легких in vivo, а также выступающей для анализа негативных последствий для здоровья O3 или других ингаляционных оскорблений.
Легкое постоянно подвергается воздействию экологических оскорблений, в том числе частиц воздуха, вирусов, бактерий и окислительных газов, которые вызывают воспаление легких1,2,3. Эти оскорбления могут поставить под угрозу газообмен и вызвать необратимые повреждения тканей4,5. Альвеолярные макрофаги, которые составляют примерно 95% иммунных клеток, найденных в мурин и легких человека при гомеостазах, являются критическими регуляторами воспаления легких после экологических оскорблений1,2, 3,4,5. Альвеолярные макрофаги имеют важное значение во время защиты хозяина путем фагоцитизации и устранения патогенных микроорганизмов. В последнее время альвеолярные макрофаги были показаны для содействия ткани гомеостаза и разрешения воспаления через эффоцитоз6,7. Эффроцитоз является фагоцитарный процесс, в котором макрофаги поглотить и устранить апоптотические клетки8,9,10. Эфтероцитоз также приводит к производству посредников (т.е., IL-10, TGF-я, PGE2, и оксида азота), что еще больше увеличить процесс, в результате чего разрешение воспаления9,10,11 ,12,16,18. Этот процесс необходим для профилактики вторичного некроза и содействия ткани гомеостаза12,13,14. Несколько исследований связали нарушения эвнерозитоза с различными хроническими заболеваниями легких, включая астму, хроническую обструктивную болезнь легких, и идиопатический легочный фиброз8,9,15, 16,17.
O3 является критерием загрязнителя воздуха, который усугубляет и увеличивает заболеваемость хроническими легочными заболеваниями19,20,21. O3 вызывает воспаление легких и травмы и, как известно, ухудшить альвеолярный макрофаг фагоцитоз бактериальных патогенов22,23. Тем не менее, неизвестно, является ли O3 ухудшает альвеолярный макрофаг энероцитоза. ИсследованиеO 3-индуцированных изменений в альвеолярных макрофаг эпрероцитоз даст потенциальное представление о том, как воздействие может привести к хронической заболеваемости легочнымзаболеванием и обострение. Ниже описан простой метод оценки альвеолярного макрофага эффоцитоза в легких самок мышей после острого воздействия O3.
Изложенный метод обладает рядом преимуществ по сравнению с другими протоколами эневоцитоза, обычно используемыми в этой области, устраняя использование дорогостоящих флуоресцентных красителей, обширные измерения цитометрии потока и манипуляции ex vivo альвеолярных макрофагов24 ,25. Кроме того, этот протокол измеряет альвеолярный макрофаг энероцитоз в контексте микроокружения легких, который может влиять на функцию макрофагов.
Эффероцитоз является противовоспалительным процессом, в котором макрофаги очистить апоптотические клетки и мусор, а также производить несколько противовоспалительных посредников9,10,11,12,16 ,…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование финансируется Институтом воздействия на здоровье Уолтера А. Розенблита премии и NIEHS R01ES028829 (к K. M. G). Мы хотели бы поблагодарить д-р Дайан Уолтерс (Департамент физиологии, ECU) за ее помощь в получении репрезентативных изображений альвеолярных макрофагов.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |