Цель этой методологии заключается в выявлении раковых стволовых клеток (CSC) в раковых клеточных линиях и первичных образцах опухолей человека с помощью протокола формирования сферы, в надежной манере, используя функциональные анализы и фенотипическую характеристику с цитометрией потока и западной Пятно.
Раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой небольшую популяцию с самообновлениеи и пластичности, которые отвечают за опухолевое, устойчивость к лечению и рецидивирующие заболевания. Эта популяция может быть идентифицирована по поверхностным маркерам, ферментативной активности и функциональному профилю. Эти подходы как таковые ограничены из-за фенотипической неоднородности и пластичности CSC. Здесь мы обновляем протокол формирования сферы для получения сфер CSC от рака молочной железы и гинекологических, оценивая функциональные свойства, маркеры CSC и экспрессию белка. Сферы получаются с одноклеточным посевом при низкой плотности в культуре подвески, используя полутвердую среду метилцеллюлозы, чтобы избежать миграции и агрегатов. Этот выгодный протокол может быть использован в линиях раковых клеток, но и в первичных опухолей. Трехмерная культура неприсоединения подвески, которая, как считается, имитирует микроокружение опухоли, особенно CSC-niche, дополнена эпидермальным фактором роста и основным фактором роста фибробластов для обеспечения сигнализации CSC. Стремясь к надежной идентификации CSC, мы предлагаем дополнительный подход, сочетающий функциональную и фенотипическую оценку. Сфераобразная способность, самообновление и область проекции сферы устанавливают функциональные свойства CSC. Кроме того, характеристика включает в себя цитометрию потока оценки маркеров, представленных CD44и/CD24– и CD133, и западный пятно, учитывая ALDH. Представленный протокол был также оптимизирован для первичных образцов опухоли, после процедуры пищеварения образца, полезной для трансляционных исследований.
Популяции рака неоднородны, с клетками, представляющими различные морфологии, пролиферации и вторжения потенциала, из-за дифференциальной экспрессии генов. Среди этих клеток, меньшинство населения существует названный рак стволовых клеток (CSC)1, которые имеют возможность для самообновления, повторяя неоднородность первичной ниши опухоли и производство аберрантично дифференциации прародителей, которые не реагируют адекватно гомеостатической контроля2. Свойства CSC могут быть непосредственно переведены в клинической практике, учитывая связь с событиями, такими как опухолевость или устойчивость к химиотерапии3. Идентификация CSC может привести к разработке целевых методов лечения, которые могут включать блокировку поверхностных маркеров, продвижение дифференциации CSC, блокирование компонентов сигнальных путей CSC, разрушение ниши и эпигенетические механизмы4.
Изоляция CSC была выполнена в линиях клеток и в образцах первичных опухолей5,6,7,8. Функциональный профиль, описанный для CSC, включает клоногенную емкость, боковое население и образование опухоли9. CD44высокий/CD24низкий фенотип был последовательно связан с груди CSC, которая оказалась опухолевой in vivo и уже был связан с эпителией к мезенхимального перехода5,10. Высокая активность ALDH также была связана со стеблей и эпителией к мезенхимальному переходу (EMT) в нескольких типах твердых опухолей11. ВЫРАЖЕНИЕ ALDH было связано с устойчивостью к химиотерапии и к phenotype CSC in vitro12,13,14,15,16. Несколько других маркеров были связаны с свойствами CSC в различных типах опухолей, таких как CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 и другие, как описано в таблице 1.
Опухоли состоят из трехмерной модели для изучения и расширения CSC. В этой модели, клеточные суспензии от клеточных линий и из крови или опухоли образцов культивируются в среде дополняется факторами роста, а именно эпидермальный фактор роста (EGF) и основной фактор роста фибробластов (bFGF), без сыворотки крупного рогатого скота плода и в неприсоединения условиях17. Ингибирование клеточной адгезии приводит к смерти от ануикиса дифференцированных клеток18. Сферы являются производными от клонального роста изолированной клетки. Для этого клетки распределяются при низкой плотности, чтобы избежать слияния клеток и агрегации19. Другая стратегия включает в себя использование полутвердых метилцеллюлозы20.
Протокол формирования сферы приобрел популярность в изоляции и расширении CSC, благодаря времени и стоимости и техническим, прибыльным и воспроизводимым причинам21,22. Несмотря на некоторые резервы, по степени формирования сферы которых отражает ЦСК, существует склонность стволовых клеток к росту в неприсоединения с характерным фенотипом, который напоминает родную микросреду21. Ни один из методов, доступных для изоляции CSC от твердых опухолей, не имеет полной эффективности, подчеркивая важность разработки более конкретных маркеров или комбинаций методологий и маркеров.
В этом протоколе мы подробно описываем изоляцию CSC с протоколом формирования сферы, с принципом одноклеточного роста в условиях неприсоединения и способностью производить дифференцированный фенотип. Схематическое представление этой процедуры представлено на рисунке 1. Мы также описываем характеристику с поверхностными маркерами и выражением ALDH для CSC, как для линий опухолевых клеток молочной и гинекологических, так и образцов первичных опухолей.
Этот протокол детализирует подход для того чтобы получить tumorspheres от линий клетки рака и главным образом людских образцов. Опухоли обогащаются в субпопуляции со стволовыми клетками, как свойства36. Это обогащение в CSC зависит от жизнеспособности в среде, свободной от крепле?…
The authors have nothing to disclose.
Это исследование было профинансировано Португальским обществом гинекологии в рамках Исследовательской премии 2016 года и CIMAGO. Чпу. IBILI поддерживается через Фонд науки и техники, Португалия (UID/NEU/04539/2013), и совместно финансируется FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). Больница Коимбра и Университетский центр (ЧУК) Опухолевый банк, утвержденный Комитетом по этике ЧУК по здравоохранению и Португальской национальной комиссией по защите данных, был источником экскутриции пациентов, за которыми следовали в гинекологической службе учреждения. Рисунок 1 был произведен с использованием Сервье медицинского искусства, доступные из www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |