מטרת מתודולוגיה זו היא לזהות את תאי גזע הסרטן (csc) בקווי התאים של סרטן ודגימות הגידול האנושי הראשוני עם הפרוטוקול ליצירת כדור, בצורה איתנה, באמצעות בחני פונקציונלי ואפיון פנוטימית עם זרימה cy, try ומערבי מחוק.
תאי גזע סרטניים (CSC) הם אוכלוסיה קטנה עם התחדשות עצמית ופלסטיות אשר אחראים tumorigenesis, עמידות לטיפול ומחלות חוזרות ונשנות. אוכלוסיה זו יכולה להיות מזוהה על ידי סמנים פני השטח, פעילות אנזימטית ופרופיל פונקציונלי. גישות אלה לכשעצמו מוגבלות, בשל הפלסטיות הטרוגניות ו-CSC. כאן, אנו לעדכן את פרוטוקול יוצרי הספירה כדי להשיג כדורים CSC מסרטן השד גינקולוגית, הערכת תכונות פונקציונלי, סמנים CSC וביטוי חלבון. התחומים מתקבלים עם שימוש בתאי יחיד בצפיפות נמוכה בתרבות ההשעיה, באמצעות מדיום חצי מוצק מתילצלולוזה כדי למנוע הגירה ואגרגטים. פרוטוקול זה רווחי ניתן להשתמש בקווי תאים סרטניים, אלא גם בגידולים ראשוניים. התרבות הטריממדי הלא חסיד ההשעיה חשב לחקות את מיקרוסביבה הגידול, במיוחד CSC-נישה, הוא שיושלם עם גורם גדילה באפידרמיס וגורם גדילה בסיסי הפיצוץ כדי להבטיח איתות CSC. במטרה לזהות חזקה של CSC, אנו מציעים גישה משלימה, שילוב פונקציונלי הערכה פנוטימית. יכולת להרכיב כדור, אזור התחדשות עצמית והקרנת כדור ליצור תכונות פונקציונליות CSC. בנוסף, האפיון כולל את הערכת הזרימה של הסמנים, המיוצגים על ידי CD44+/Cd24-ו- CD133, ואבן החשופה המערבית, בהתחשב ב-aldh. הפרוטוקול המוצג היה גם אופטימיזציה עבור דגימות הגידול הראשוני, בעקבות הליך העיכול לדוגמה, שימושי עבור מחקר טרנסלtional.
אוכלוסיות סרטן הן הטרוגנית, עם תאים המציגים מורפולוגיות שונות, התפשטות וקיבולת הפלישה, בשל ביטוי גנים דיפרנציאלי. בין תאים אלה, אוכלוסיית המיעוט קיים בשם תאים גזע הסרטן (CSC)1, אשר יש את היכולת של התחדשות עצמית, לכידה של טרוגניות של נישה הגידול העיקרי והפקת מושלתי בצורה מאוד מבדילים שאינם מגיבים כראוי להומטיק שולטת2. מאפייני CSC ניתן לתרגם ישירות בפרקטיקה הקלינית, בהתחשב הקשר עם אירועים, כגון התנגדות או עמידות כימותרפיה3. הזיהוי של CSC יכול להוביל לפיתוח של טיפולים ייעודיים העשויים לכלול חסימה של סמנים פני השטח, קידום של בידול CSC, חסימת של רכיבים מסלול איתות CSC, השמדת נישה, ו אפיגנטי מנגנונים4.
בידוד של csc כבר בוצע קווי תאים בדגימות של גידולים ראשוניים5,6,7,8. הפרופיל הפונקציונלי המתואר עבור CSC כולל קיבולת הקלקגנטית, האוכלוסייה הצדדית והיווצרות מוורוספירה9. CD44גבוהה/cd24הנמוכה פנוטיפים הקשורים בעקביות עם השד csc, אשר הוכיחה להיות tuמוריגניים ב vivo והיה כבר קשור האפיתל למעבר mesenchymal5,10. פעילות ALDH גבוהה היתה גם קשורה עם שכניות ואפיתל למעבר mesenchymal (האמבולנס) בכמה סוגים של גידולים מוצק11. Aldh ביטוי נקשר עם עמידות כימותרפיה ו csc פנוטיפ בחוץ מבחנה12,13,14,15,16. מספר סמנים אחרים קושרו למאפייני csc בסוגים שונים של גידולים, כגון CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 ואחרים, כמתואר בטבלה 1.
הספירות מורכבות ממודל תלת-מימדי לחקר והתרחבות של CSC. במודל זה, התא השעיות מקווי התא ומדגימות הדם או הגידול מעובדות במדיום שיושלם עם גורמי גדילה, כלומר גורם גידול באפידרמיס (EGF) ו בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ גורם (bFGF), ללא סרום של שור עוברי ו בתנאים שאינם חסיד17. עיכוב של הדבקה תא תוצאות מוות על ידי אנואיקיס של תאים הבדיל18. הספירות נגזרות מצמיחת המשובטים של תא מבודד. למטרה זו, התאים מופצים בצפיפות נמוכה כדי למנוע פיוז ‘ ן תא וצבירה19. אסטרטגיה נוספת כוללת את השימוש בוצק מתילתאית20.
הפרוטוקול יוצר הספירה זכה לפופולריות בבידוד csc והתרחבות, עקב הזמן והעלות והסיבות הטכניות, הרווחיות והאנטי-21,22. למרות שמורות מסוימות במידה של היווצרות הספירה משקפת CSC, יש נטייה של תאי גזע לצמוח בתנאים שאינם חסיד עם פנוטיפ אופייני, אשר דומה המיקרו הסביבה הטבעית21. אף אחת השיטות הזמינות עבור בידוד של CSC מפני גידולים מוצקים יש יעילות מלאה, הדגשת החשיבות של פיתוח סמנים ספציפיים יותר או שילובים של מתודולוגיות סמנים.
בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הבידוד של CSC עם פרוטוקול יוצרי הספירה, עם העיקרון של צמיחה תא יחיד בתנאים שאינם חסיד ויכולת לייצר פנוטיפ הבדיל. ייצוג סכמטי של הליך זה מיוצג באיור 1. אנו מתארים גם את האפיון עם סמנים פני השטח וביטוי ALDH עבור CSC, הן עבור השד תאים סרטניים גינקולוגית קווים ודגימות של גידולים ראשוניים.
פרוטוקול זה מפרט גישה להשגת כדורים מתאי סרטן ודגימות אנושיות ראשיות. כדורים מועשר בתתי-אוכלוסיה עם מאפיינים כמו תאי גזע36. העשרה זו ב CSC תלויה הכדאיות בסביבה מעגן ללא התאים בזמן הבדיל מסתמך על הדבקה37מצע. כמו ציפוי ראשוני של תאים סרטניים בסביבה הקפדה נמוכה הכופה הה?…
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי האגודה הפורטוגזית של גניקולוגיה באמצעות פרס 2016 מחקר על ידי CIMAGO. CNC. IBILI נתמך באמצעות הקרן עבור מדע וטכנולוגיה, פורטוגל (UID//או/04539/2013), ובמימון שיתוף על ידי פדר-להתחרות (POCI-01-0145-פדר-007440). בית החולים של קוימברה ומרכז האוניברסיטה (CHUC) בבנק הגידול, אושרה על ידי ועדת האתיקה של CHUC לבריאות ועל ידי הוועדה הלאומית להגנת נתונים פורטוגזית, היה המקור של דגימות רירית הרחם של חולים ואחריו בשירות גניקולוגיה של המוסד. איור 1 הופק בעזרת Servier אמנות רפואית, זמין מ www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |