Ziel dieser Methodik ist es, Krebsstammzellen (CSC) in Krebszelllinien und primären menschlichen Tumorproben mit dem kugelbildenden Protokoll auf robuste Weise zu identifizieren, wobei funktionelle Assays und phänotypische Charakterisierung mit Durchflusszytometrie und western Fleck.
Krebsstammzellen (CSC) sind eine kleine Population mit Selbsterneuerung und Plastizität, die für Tumorgenese, Resistenz gegen Behandlung und wiederkehrende Krankheiten verantwortlich sind. Diese Grundgesamtheit kann durch Oberflächenmarker, enzymatische Aktivität und ein funktionelles Profil identifiziert werden. Diese Ansätze an sich sind aufgrund der phänotiver Heterogenität und CSC-Plastizität begrenzt. Hier aktualisieren wir das kugelbildende Protokoll, um CSC-Kugeln aus Brust- und gynäkologischen Krebsarten zu erhalten und funktionelle Eigenschaften, CSC-Marker und Proteinexpression zu bewerten. Die Kugeln werden mit einzelliger Aussaat bei geringer Dichte in Suspensionskultur unter Verwendung eines halbfesten Methylcellulosemediums gewonnen, um Migration und Aggregate zu vermeiden. Dieses profitable Protokoll kann in Krebszelllinien, aber auch in Primärtumoren verwendet werden. Die dreidimensionale nicht-haftende Suspensionskultur, die die Tumormikroumgebung, insbesondere die CSC-Nische, imitiert, wird durch einen epidermalen Wachstumsfaktor und einen grundlegenden Fibroblasten-Wachstumsfaktor ergänzt, um die CSC-Signalisierung zu gewährleisten. Mit dem Ziel einer robusten Identifizierung von CSC schlagen wir einen komplementären Ansatz vor, der funktionale und phänotypische Evaluierung kombiniert. Kugelbildende Kapazität, Selbsterneuerung und Kugelprojektionsfläche etablieren CSC-Funktionseigenschaften. Darüber hinaus umfasst die Charakterisierung die Flow-Zytometrie-Auswertung der Marker, dargestellt durch CD44+/CD24– und CD133 und Western Blot, unter Berücksichtigung von ALDH. Das vorgestellte Protokoll wurde auch für primäre Tumorproben optimiert, nach einem Probenverdauungsverfahren, das für die translationale Forschung nützlich ist.
Krebspopulationen sind heterogen, wobei Zellen aufgrund der differenziellen Genexpression unterschiedliche Morphologien, Proliferations- und Invasionsfähigkeit darstellen. Unter diesen Zellen existiert eine Minderheitspopulation namens Krebsstammzellen (CSC)1, die die Fähigkeit zur Selbsterneuerung haben, die Heterogenität der primären Tumornische rekapitulieren und abnorm differenzierende Vorläufer produzieren, die nicht angemessen auf homöostatische Kontrollen reagieren2. CSC-Eigenschaften können direkt in der klinischen Praxis übersetzt werden, da die Assoziation mit Ereignissen, wie Tumorigenität oder Resistenz gegen Chemotherapie3. Die Identifizierung von CSC kann zur Entwicklung gezielter Therapien führen, die die Blockade von Oberflächenmarkern, die Förderung der CSC-Differenzierung, die Blockierung von CSC-Signalwegkomponenten, Nischenzerstörung und epigenetische Mechanismen umfassen können4.
Die Isolierung von CSC wurde in Zelllinien und in Proben von Primärtumoren5,6,7,8durchgeführt. Das für CSC beschriebene funktionelle Profil umfasst clonogene Kapazität, Seitenpopulation und Tumorkugelbildung9. Der CD44high/CD24low phänotyp wurde konsequent mit Brust-CSC assoziiert, das sich in vivo als tumoriogen erwiesen hat und bereits mit epitheliadem zu mesenchymalem Übergang5,10assoziiert wurde. Hohe ALDH-Aktivität wurde auch mit Stammheit und epitheliale mesenchymale Minase (EMT) bei verschiedenen Arten von soliden Tumoren11assoziiert. Die ALDH-Expression wurde mit einer Resistenz gegen Chemotherapie und CSC-Phänotyp in vitro12,13,14,15,16assoziiert. Mehrere andere Marker wurden mit CSC-Eigenschaften in verschiedenen Tumorarten verknüpft, wie CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 und andere, wie in Tabelle 1beschrieben.
Die Tumorsphären bestehen aus einem dreidimensionalen Modell für die Untersuchung und Expansion von CSC. In diesem Modell werden die Zellsuspensionen aus Zelllinien und aus Blut- oder Tumorproben in einem Medium kultiviert, das mit Wachstumsfaktoren ergänzt wird, nämlich epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), ohne fetales Rinderserum und unter nicht haftenden Bedingungen17. Hemmung der Zelladhäsion führt zum Tod durch Anoikis von differenzierten Zellen18. Kugeln werden aus dem klonalen Wachstum einer isolierten Zelle abgeleitet. Zu diesem Zweck werden die Zellen mit geringer Dichte verteilt, um Zellfusion und Aggregation zu vermeiden19. Eine weitere Strategie umfasst die Verwendung von halbkonsolidierter Methylcellulose20.
Das kugelbildende Protokoll gewann an Popularität in Derise und Erweiterung von CSC, aufgrund von Zeit und Kosten und technischen, profitablen und reproduzierbaren Gründen21,22. Trotz einiger Reserven, deren Ausmaß die Kugelbildung CSC widerspiegelt, besteht eine Neigung von Stammzellen, unter nicht anhaftenden Bedingungen mit dem charakteristischen Phänotyp zu wachsen, der der nativen Mikroumgebung ähnelt21. Keine der verfügbaren Methoden zur Isolierung von CSC von soliden Tumoren hat eine vollständige Effizienz, was die Bedeutung der Entwicklung spezifischerer Marker oder Kombinationen von Methoden und Markern unterstreicht.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung von CSC mit dem kugelbildenden Protokoll, mit dem Prinzip des einzelzelligen Wachstums unter nicht haftenden Bedingungen und der Fähigkeit, einen differenzierten Phänotyp zu erzeugen. Eine schematische Darstellung dieser Prozedur ist in Abbildung 1dargestellt. Wir beschreiben auch die Charakterisierung mit Oberflächenmarkern und ALDH-Expression für CSC, sowohl für Brust- als auch für gynäkologische Tumorzellenlinien und Proben von Primärtumoren.
Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zur Gewinnung von Tumorsphären aus Krebszelllinien und primären menschlichen Proben. Tumorsphären werden in einer Unterpopulation mit Stammzell-ähnlichen Eigenschaften angereichert36. Diese Anreicherung in CSC ist abhängig von der Lebensfähigkeit in einer ankerfreien Umgebung, während differenzierte Zellen auf die Haftung auf einem Substrat angewiesen sind37. Da die primäre Beschichtung von Tumorzellen in einer Umgebung mit g…
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von der Portugiesischen Gesellschaft für Gynäkologie durch den Forschungspreis 2016 und von CIMAGO finanziert. Cnc. IBILI wird von der Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) unterstützt und von FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440) kofinanziert. Die Tumorbank des Coimbra Hospital and Universitary Center (CHUC), die von der Ethikkommission für Gesundheit des CHUC und der portugiesischen Nationalen Datenschutzkommission genehmigt wurde, war die Quelle von Endometriumproben von Patienten, die beim Gynäkologiedienst der Einrichtung durchgeführt wurden. Abbildung 1 wurde mit Servier Medical Art erstellt, erhältlich bei www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |