L’objectif de cette méthodologie est d’identifier les cellules souches cancéreuses (CSC) dans les lignées de cellules cancéreuses et les échantillons primaires de tumeurs humaines avec le protocole de formation de sphère, d’une manière robuste, en utilisant des essais fonctionnels et la caractérisation phénotypique avec cytométrie du flux et de l’Ouest Tache.
Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une petite population avec l’auto-renouvellement et la plasticité qui sont responsables de la tumorigénèse, la résistance au traitement et la maladie récurrente. Cette population peut être identifiée par des marqueurs de surface, une activité enzymatique et un profil fonctionnel. Ces approches en soi sont limitées, en raison de l’hétérogénéité phénotypique et de la plasticité du SCC. Ici, nous mettons à jour le protocole de formation de sphère pour obtenir des sphères de CSC des cancers du sein et gynécologiques, évaluant des propriétés fonctionnelles, des marqueurs de CSC et l’expression de protéine. Les sphères sont obtenues avec l’ensemencement unicellulaire à faible densité dans la culture de suspension, en utilisant un milieu semi-solide de méthylcellulose pour éviter la migration et les agrégats. Ce protocole rentable peut être utilisé dans les lignées cellulaires cancéreuses, mais aussi dans les tumeurs primaires. La culture tridimensionnelle de suspension non-adhérente pensée pour imiter le microenvironnement de tumeur, particulièrement le CSC-niche, est complétée avec le facteur épidermique de croissance et le facteur de croissance de base de fibroblaste pour assurer la signalisation de CSC. Visant une identification robuste du SCC, nous proposons une approche complémentaire, combinant l’évaluation fonctionnelle et phénotypique. La capacité de formation de sphère, l’auto-renouvellement et la zone de projection de sphère établissent des propriétés fonctionnelles de CSC. En outre, la caractérisation comprend l’évaluation de la cytométrie du débit des marqueurs, représentés par CD44/CD24– et CD133, et Western blot, compte tenu de l’ALDH. Le protocole présenté a également été optimisé pour les échantillons primaires de tumeur, suivant une procédure de digestion d’échantillon, utile pour la recherche translationnelle.
Les populations cancéreuses sont hétérogènes, avec des cellules présentant différentes morphologies, la prolifération et la capacité d’invasion, en raison de l’expression différentielle des gènes. Parmi ces cellules, une population minoritaire existe des cellules souches cancéreuses (CSC)1, qui ont la capacité d’auto-renouvellement, récapitulant l’hétérogénéité de la niche tumorale primaire et produisant des progéniteurs aberrants différenciants qui ne répondent pas adéquatement aux contrôles homéostatiques2. Les propriétés de CSC peuvent être directement traduites dans la pratique clinique, étant donné l’association avec des événements, tels que la tumorigénicité ou la résistance à la chimiothérapie3. L’identification du SCC peut mener à la mise au point de thérapies ciblées qui peuvent inclure le blocage des marqueurs de surface, la promotion de la différenciation du SCC, le blocage des composantes de la voie de signalisation du SCC, la destruction des niches et les mécanismes épigénétiques4.
L’isolement du SCC a été effectué dans les lignées de cellules et dans des échantillons de tumeurs primaires5,6,7,8. Le profil fonctionnel décrit pour le SCC comprend la capacité clonogène, la population latérale et la formation de tumorosphère9. Le phénotypefaible cD44élevé/CD24 a été uniformément associé au CSC de sein, qui s’est avéré être tumorigenic in vivo et a été déjà associé à la transition épithéliale à la transition mésenchymale5,10. L’activité élevée d’ALDH a été également associée à la tige et à la transition épithéliale à la transition mésenchymale (EMT) dans plusieurs types de tumeurs pleines11. L’expression d’ALDH a été associée à la résistance à la chimiothérapie et au phénotype de CSC in vitro12,13,14,15,16. Plusieurs autres marqueurs ont été liés aux propriétés du SCC dans différents types de tumeurs, comme CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 et d’autres, comme décrit dans le tableau 1.
Les tumorspheres se composent d’un modèle tridimensionnel pour l’étude et l’expansion de CSC. Dans ce modèle, les suspensions cellulaires des lignées cellulaires et des échantillons de sang ou de tumeur sont cultivées dans un milieu complété par des facteurs de croissance, à savoir le facteur de croissance épidermique (EGF) et le facteur de croissance de base du fibroblaste (bFGF), sans sérum bovin fœtal et dans des conditions non adhérentes17. L’inhibition de l’adhérence cellulaire entraîne la mort par anoikis de cellules différenciées18. Les sphères sont dérivées de la croissance clonale d’une cellule isolée. À cette fin, les cellules sont distribuées à faible densité pour éviter la fusion cellulaire et l’agrégation19. Une autre stratégie comprend l’utilisation de la méthylcellulose semi-solide20.
Le protocole de formation de sphère a gagné la popularité dans l’isolement et l’expansion de CSC, en raison du temps et du coût et des raisons techniques, profitables, et reproductibles21,22. Malgré certaines réserves sur l’étendue de la formation de sphère soumet le SCC, il y a une propension des cellules souches à se développer dans des conditions non adhérentes avec le phénotype caractéristique, qui ressemble au microenvironnement indigène21. Aucune des méthodes disponibles pour l’isolement du SCC des tumeurs pleines n’a l’efficacité complète, soulignant l’importance de développer des marqueurs plus spécifiques ou des combinaisons des méthodologies et des marqueurs.
Dans ce protocole, nous détaillons l’isolement du SCC avec le protocole de formation de sphère, avec le principe de la croissance unicellulaire dans des conditions non adhérentes et la capacité de produire un phénotype différencié. Une représentation schématique de cette procédure est représentée à la figure 1. Nous décrivons également la caractérisation avec des marqueurs de surface et l’expression d’ALDH pour CSC, pour des lignes de cellules de tumeur de sein et gynécologiques et des échantillons des tumeurs primaires.
Ce protocole détaille une approche pour obtenir des tumorspheres des lignées de cellules cancéreuses et des échantillons humains primaires. Les tumorsphères sont enrichies dans une sous-population avec des propriétés de cellules souches36. Cet enrichissement au SCC dépend de la viabilité dans un environnement sans ancrage alors que les cellules différenciées dépendent de l’adhérence à un substrat37. Comme le placage primaire des cellules tumorales dans un en…
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par la Société portugaise de gynécologie par le Prix de recherche 2016 et par CIMAGO. Cnc. L’IBILI est soutenue par la Fondation pour la science et la technologie, Portugal (UID/NEU/04539/2013), et cofinancée par FEDER-COMPETE (POCI-01-01-0145-FEDER-007440). La Banque de tumeurs de l’Hôpital et du Centre Universitaire de Coimbra (CHUC), agréée par le Comité d’éthique de la santé du CHUC et par la Commission nationale portugaise de protection des données, a été la source d’échantillons d’endomètre de patients suivis au Service de gynécologie de l’établissement. Figure 1 a été produite à l’aide de Servier Medical Art, disponible à partir de www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |