Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.
Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una piccola popolazione con auto-rinnovamento e plasticità che sono responsabili della tumoralgenesi, resistenza al trattamento e malattia ricorrente. Questa popolazione può essere identificata da indicatori di superficie, attività enzimatica e un profilo funzionale. Questi approcci di per sé sono limitati, a causa dell’eterogeneità fenotipica e della plasticità del CSC. Qui aggiorniamo il protocollo di formazione delle sfere per ottenere sfere CSC da tumori al seno e ginecologici, valutando le proprietà funzionali, i marcatori CSC e l’espressione proteica. Le sfere sono ottenute con semina unicellulare a bassa densità nella coltura delle sospensioni, utilizzando un mezzo di metilcellulosa semi-solido per evitare migrazioni e aggregati. Questo protocollo redditizio può essere utilizzato nelle linee cellulari del cancro, ma anche nei tumori primari. La coltura tridimensionale di sospensioni non aderenti pensa di imitare il microambiente tumorale, in particolare la nicchia CSC, è completata da un fattore di crescita epidermico e da un fattore di crescita fibroblasto di base per garantire la segnalazione CSC. Con l’obiettivo di un’identificazione robusta del CSC, proponiamo un approccio complementare, che combina la valutazione funzionale e fenotipica. Capacità di formazione della sfera, auto-rinnovamento e area di proiezione della sfera stabiliscono le proprietà funzionali del CSC. Inoltre, la caratterizzazione comprende la valutazione della citometria di flusso dei marcatori, rappresentata da CD44–/CD24– e CD133 e Western blot, considerando ALDH. Il protocollo presentato è stato ottimizzato anche per i campioni di tumore primario, seguendo una procedura di digestione dei campioni, utile per la ricerca traslazionale.
Le popolazioni di cancro sono eterogenee, con cellule che presentano diverse morfologie, proliferazione e capacità di invasione, a causa dell’espressione genica differenziale. Tra queste cellule, esiste una popolazione minoritaria chiamata cellule staminali tumorali (CSC)1, che hanno la capacità di auto-rinnovamento, ricapitolando l’eterogeneità della nicchia tumorale primaria e producendo progenitori aberranti che non rispondono adeguatamente ai controlli omeostatici2. Le proprietà CSC possono essere tradotte direttamente nella pratica clinica, data l’associazione con eventi, come la tumorigenicità o la resistenza alla chemioterapia3. L’identificazione del CSC può portare allo sviluppo di terapie mirate che possono includere il blocco dei marcatori di superficie, la promozione della differenziazione del CSC, il blocco dei componenti del percorso di segnalazione CSC, la distruzione di nicchia e i meccanismi epigenetici4.
L’isolamento del CSC è stato eseguito nelle linee delle cellule e nei campioni di tumori primari5,6,7,8. Il profilo funzionale descritto per il CSC include la capacità clonogenica, la popolazione laterale e la formazione della tumorosfera9. Il fenotipobasso CD44alto/CD24 è stato costantemente associato al CSC al seno, che si è dimostrato cancerogeno in vivo ed è già stato associato con la transizione epiteliale a mesenchymic5,10. Alta attività ALDH è stata anche associata con stelo ed epiteliale alla transizione mesenchymica (EMT) in diversi tipi di tumori solidi11. Espressione ALDH è stata associata con resistenza alla chemioterapia e al fenotipo CSC in vitro12,13,14,15,16. Diversi altri marcatori sono stati collegati alle proprietà CSC in diversi tipi di tumori, come CD133, CD49f, ITGA6, CD1663,4 e altri, come descritto nella tabella 1.
Le sfere tumorali consistono in un modello tridimensionale per lo studio e l’espansione del CSC. In questo modello, le sospensioni cellulari da linee cellulari e da campioni di sangue o tumore sono coltivati in un mezzo integrato con fattori di crescita, vale a dire fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita fibroblasto di base (bFGF), senza siero bovino fetale e in condizioni non aderenti17. L’inibizione dell’adesione cellulare provoca la morte da parte di anoikis di cellule differenziate18. Le sfere derivano dalla crescita clonale di una cellula isolata. A tale scopo, le celle sono distribuite a bassa densità per evitare la fusione cellulare el’aggregazione 19. Un’altra strategia include l’uso di metilcellulosa semisolida20.
Il protocollo di formazione a sfera ha guadagnato popolarità nell’isolamento e nell’espansione del CSC, a causa dei tempi e dei costi e dei motivi tecnici, redditizi e riproducibili21,22. Nonostante alcune riserve sull’estensione di quale formazione di sfera rifletta il CSC, vi è una propensione delle cellule staminali a crescere in condizioni non aderenti con il caratteristico fenotipo, che assomiglia al microambiente nativo21. Nessuno dei metodi disponibili per l’isolamento del CSC dai tumori solidi ha una completa efficienza, evidenziando l’importanza di sviluppare marcatori più specifici o combinazioni di metodologie e marcatori.
In questo protocollo, dettagliamo l’isolamento del CSC con il protocollo di formazione della sfera, con il principio della crescita a singola cellula in condizioni non aderenti e la capacità di produrre un fenotipo differenziato. Una rappresentazione schematica di questa procedura è rappresentata nella Figura 1. Descriviamo anche la caratterizzazione con marcatori di superficie ed espressione ALDH per CSC, sia per le linee di cellule tumorali mammarie e ginecologiche e campioni di tumori primari.
Questo protocollo descrive in dettaglio un approccio per ottenere le sfere tumorali dalle linee cellulari tumorali e dai campioni umani primari. Le sfere tumorali sono arricchite in una sottopopolazione con proprietà simili a cellule staminali36. Questo arricchimento nel CSC dipende dalla vitalità in un ambiente privo di ancoraggio, mentre le cellule differenziate dipendono dall’adesione a un substrato37. Poiché la placcatura primaria delle cellule tumorali in un ambient…
The authors have nothing to disclose.
Questo studio è stato finanziato dalla Società portoghese di ginecologia attraverso il Premio Ricerca 2016 e da CIMAGO. Cnc. IBILI è sostenuta attraverso la Foundation for Science and Technology, Portugal (UID/NEU/04539/2013) e co-finanziata da FEDER-COMPETE (POCI-01-0145-FEDER-007440). L’Ospedale Coimbra e la Banca del tumore del Centro Universitario (CHUC), approvato dal Comitato Etico per la Salute del CHUC e dalla Commissione nazionale portoghese per la protezione dei dati, è stata la fonte di campioni endometriali di pazienti seguiti presso il servizio di ginecologia dell’istituzione. La Figura 1 è stata prodotta utilizzando Servier Medical Art, disponibile da www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |