والهدف من هذه المنهجية هو تحديد الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) في خطوط الخلايا السرطانية وعينات الأورام البشرية الأولية مع بروتوكول تشكيل الكرة ، بطريقة قوية ، وذلك باستخدام العينات الوظيفية والتوصيف فينوتيبيك مع قياس التدفق الخلوي والغربية لطخه.
الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) هي مجموعة صغيرة من السكان مع التجديد الذاتي واللدونة التي هي المسؤولة عن تكوين الورم، ومقاومة للعلاج والأمراض المتكررة. ويمكن تحديد هذه الكثافة السكانية من خلال علامات السطح والنشاط الأنزيمي والصورة الوظيفية. هذه النهج في حد ذاتها محدودة ، بسبب عدم التجانس فينوتيبيك واللدونة CSC. هنا، نقوم بتحديث بروتوكول تشكيل الكرة للحصول على مجالات CSC من سرطان الثدي وأمراض النساء، وتقييم الخصائص الوظيفية، وعلامات CSC والتعبير البروتين. يتم الحصول على المجالات مع البذر خلية واحدة في كثافة منخفضة في ثقافة التعليق، وذلك باستخدام متوسطة ميثيل سيلولوز شبه الصلبة لتجنب الهجرة والمجاميع. يمكن استخدام هذا البروتوكول المربح في خطوط الخلايا السرطانية ولكن أيضًا في الأورام الأولية. ثقافة تعليق ثلاثيالأبعاد غير ملتصقة يعتقد أن تحاكي البيئة الدقيقة الورم، ولا سيما CSC-المتخصصة، وتستكمل مع عامل نمو البشرة وعامل النمو الليفي الأساسي لضمان إشارات CSC. وبهدف التحديد القوي لـ CSC، نقترح نهجاً تكميلياً يجمع بين التقييم الوظيفي والتقييم المنسب. قدرة تشكيل المجال، والتجديد الذاتي ومنطقة إسقاط الكرة إنشاء خصائص وظيفية CSC. بالإضافة إلى ذلك ، يشمل التوصيف تقييم قياس التدفق الخلوي للعلامات ، ممثلة في CD44+/ CD24– و CD133 ، ولطخة غربية ، مع الأخذ في الاعتبار ALDH. كما تم تحسين البروتوكول المقدم لعينات الورم الأولية ، بعد إجراء هضم العينة ، مفيدًا للأبحاث الانتقالية.
مجموعات السرطان غير متجانسة، مع الخلايا التي تقدم مختلف مورفولوجيا، والانتشار والقدرة على الغزو، وذلك بسبب التعبير الجيني التفاضلي. من بين هذه الخلايا ، يوجد عدد أقلية من الخلايا الجذعية السرطانية (CSC)1، التي لديها القدرة على التجديد الذاتي ، وتلخيص عدم تجانس مكانة الورم الأساسي وإنتاج السلف التمييز بشكل شاذ التي لا تستجيب بشكل كاف للضوابط المثلية2. يمكن ترجمة خصائص CSC مباشرة في الممارسة السريرية ، بالنظر إلى الارتباط بالأحداث ، مثل الورم أو مقاومة العلاج الكيميائي3. يمكن أن يؤدي تحديد CSC إلى تطوير العلاجات المستهدفة التي قد تشمل انسداد علامات السطح ، وتعزيز التمايز CSC ، ومنع مكونات مسار إشارة CSC ، وتدمير المتخصصة ، والآليات اللاجينية4.
وقد تم إجراء عزل CSC في خطوط الخلايا وفي عينات من الأورام الأولية5،6،7،8. يتضمن الملف الوظيفي الموصوف لـ CSC القدرة على الكلونية والسكان الجانبيين وتشكيل الورم9. وقد ارتبط CD44عالية/ CD24 النمط الظاهريمنخفضة باستمرار مع لجنة الخدمة المدنية في الثدي, التي أثبتت أن الورم في الجسم الحي وارتبطت بالفعل مع الظهارية للانتقال mesenchymal5,10. وقد ارتبط نشاط ALDH عالية أيضا مع الجذعية والظهارية للانتقال mesenchymal (EMT) في عدة أنواع من الأورام الصلبة11. وقد ارتبط التعبير ALDH مع مقاومة للعلاج الكيميائي وCSC النمط الظاهري في المختبر12،13،14،15،16. وقد تم ربط العديد من العلامات الأخرى إلى خصائص CSC في أنواع مختلفة من الأورام، مثل CD133، CD49f، ITGA6، CD1663،4 وغيرها، كما هو موضح في الجدول 1.
تتكون الأورام من نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة وتوسيع CSC. في هذا النموذج ، تزرع تعليق الخلايا من خطوط الخلايا ومن عينات الدم أو الورم في متوسط مكمل بعوامل النمو ، وهي عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، دون مصل الأبقار الجنينوفي وفي الظروف غير الملتصقة17. تثبيط التصاق الخلية يؤدي إلى الموت عن طريق أنوكيس من الخلايا المتباينة18. وتستمد المجالات من النمو الكلوية لخلية معزولة. لهذا الغرض، يتم توزيع الخلايا في كثافة منخفضة لتجنب انصهار الخلايا وتجميع19. وتشمل استراتيجية أخرى استخدام ميثيل سيلولوز شبه الصلبة20.
اكتسب بروتوكول تشكيل المجال شعبية في عزلة CSC والتوسع ، وذلك بسبب الوقت والتكلفة والتقنية ، ومربحة ، وقابلة للاستنساخ21،22. على الرغم من بعض الاحتياطيات على مدى تشكيل المجال الذي يعكس CSC، هناك ميل من الخلايا الجذعية للنمو في ظروف غير ملتصقة مع النمط الظاهري المميز، الذي يشبه البيئة الدقيقة الأصلية21. لا توجد أي من الطرق المتاحة لعزل CSC من الأورام الصلبة لديها كفاءة كاملة ، مما يسلط الضوء على أهمية تطوير علامات أكثر تحديدًا أو مجموعات من المنهجيات والعلامات.
في هذا البروتوكول، نحن بالتفصيل عزل CSC مع بروتوكول تشكيل المجال، مع مبدأ نمو خلية واحدة في الظروف غير المنضمة والقدرة على إنتاج نمط ظاهري متمايزة. يتم تمثيل تخطيطي لهذا الإجراء في الشكل 1. كما وصف ناصف التوصيف مع علامات السطح والتعبير ALDH لCSC، سواء بالنسبة لخطوط خلايا أورام الثدي وأمراض النساء وعينات من الأورام الأولية.
هذا البروتوكول تفاصيل نهج للحصول على الأورام من خطوط الخلايا السرطانية والعينات البشرية الأولية. يتم إثراء الأورام في مجموعة فرعية مع خصائص تشبه الخلايا الجذعية36. يعتمد هذا الإثراء في CSC على الجدوى في بيئة خالية من الرسو في حين تعتمد الخلايا المتباينة على الالتصاق إلى الركيز…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة من قبل الجمعية البرتغالية لأمراض النساء من خلال جائزة البحوث لعام 2016 ومن قبل CIMAGO. Cnc. يتم دعم IBILI من خلال مؤسسة العلوم والتكنولوجيا، البرتغال (UID/NEU/04539/2013)، ويشارك في تمويلها فيدر-سيفيل (POCI-01-0145-FEDER-007440). كان مستشفى كويمبرا والمركز الجامعي (CHUC) بنك الأورام ، الذي وافقت عليه لجنة أخلاقيات الصحة التابعة للجنة واللجنة الوطنية البرتغالية لحماية البيانات ، مصدر عينات بطانة الرحم للمرضى الذين تمت متابعتهم في خدمة أمراض النساء في المؤسسة. تم إنتاج الشكل 1 باستخدام سيرفييه الفن الطبي، المتاحة من www.servier.com.
Absolute ethanol | Merck Millipore | 100983 | |
Accutase | Gibco | A1110501 | StemPro Accutas Cell Dissociation Reagent |
ALDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC166362 | |
Annexin V FITC | BD Biosciences | 556547 | |
Antibiotic antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
BCA assay | Thermo Scientific | 23225 | Pierce BCA Protein Assay Kit |
Bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
CD133 antibody | Miteny Biotec | 293C3-APC | Allophycocyanin (APC) |
CD24 antibody | BD Biosciences | 658331 | Allophycocyanin-H7 (APC-H7) |
CD44 antibody | Biolegend | 103020 | Pacific Blue (PB) |
Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40 µM |
Collagenase, type IV | Gibco | 17104-019 | |
cOmplete Mini | Roche | 118 361 700 0 | |
Dithiothreitol | Sigma | 43815 | |
DMEM-F12 | Sigma | D8900 | |
DNAse I | Roche | 11284932001 | |
ECC-1 | ATCC | CRL-2923 | Human endometrium adenocarcinoma cell line |
Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | |
Fibroblast growth factor basic | Sigma | F0291 | |
Haemocytometer | VWR | HERE1080339 | |
HCC1806 | ATCC | CRL-2335 | Human mammary squamous cell carcinoma cell line |
Insulin, transferrin, selenium Solution | Gibco | 41400045 | |
MCF7 | ATCC | HTB-22 | Human mammary adenocarcinoma cell line |
Methylcellulose | AlfaAesar | 45490 | |
NaCl | JMGS | 37040005002212 | |
Poly(2-hydroxyethyl-methacrylate | Sigma | P3932 | |
Putrescine | Sigma | P7505 | |
RL95-2 | ATCC | CRL-1671 | Human endometrium carcinoma cell line |
Sodium deoxycholic acid | JMS | EINECS 206-132-7 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Tris | JMGS | 20360000BP152112 | |
Triton-X 100 | Merck | 108603 | |
Trypan blue | Sigma | T8154 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | |
��-actin antibody | Sigma | A5316 |