Эта статья представляет собой полезный анализ in vitro для оценки способности условной среды из опухолевых клеток для привлечения макрофагов.
Опухолевые макрофаги (TAMs) составляют большой процент клеток в опухолевой массе для различных видов рака. Глиобластома (ГБМ), злокачественная опухоль головного мозга без лечения, имеет до половины опухолевой массы TAMs. TAMs может быть проопухолевым или противоопухолевым, в зависимости от активации конкретных генов в клетках. Генетические мутации в опухолях, путем регулирования экспрессии цитокинов, могут повлиять на набор TAMs в микросреду опухоли. Здесь мы описываем количественный анализ на основе клеток для оценки набора макрофагов условным средством из опухолевых клеток. Этот анализ использует человеческую линию макрофагов MV-4-11 для изучения притяжения макрофагов условной средой от глиобластомы, что позволяет к высокой воспроизводимости и низкой изменчивости. Данные, генерируемые с помощью этого анализа, могут способствовать лучшему пониманию взаимодействия между опухолью и микроокружением опухоли. Подобный ассс может быть использован для оценки взаимодействия между опухолевыми клетками и другими иммунными клетками, включая Т-клетки и естественные клетки-убийцы (НК).
Макрофаги являются иммунными клетками с высокой фенотипической и функциональной неоднородностью1. Они играют важную роль в системах защиты хозяина, ремонт тканей, развитие и прогрессирование опухоли1. TAMs являются макрофагами в микросреде твердых опухолей. Некоторые TAMs может способствовать росту опухоли путем ингибирования Т-клеточной цитотоксичной активности, модулируя микросреду опухоли (TME), способствуя ангиогенез, вторжение и метастазы2,3,4, 5. TAMs являются одними из наиболее распространенных типов клеток в TME и большее количество TAMs обычно коррелирует с хуже выживания пациента во многих типах твердых опухолей6. Различные генетические подписи опухолевых клеток влияют на их способность набирать макрофаги. В GBM, агрессивная опухоль мозга без лечения, макрофаги могут представлять до половины массы опухоли7. Совместное усиление рецептора эпидермального фактора роста(EGFR)и его усечения мутанта EGFRvIII часто наблюдается в ГБМ, что дает преимущества роста опухоли8. Клетки, совместно выражающие EGFR и EGFRvIII, привлекают больше макрофагов посравнению с клетками, выражающими EGFR или EGFRvIII singly 7.
Chemokines представляют собой семейство небольших цитокинов, которые играют значительную роль в регулировании иммунного состава в TME6,9. Клетки человека выражают более 50 цитокинов10. Иммунная инфильтрация в опухолях в значительной степени реализуется путем взаимодействия между цитокинов и цитокиновых рецепторов11. Каждый тип иммунных клеток выражает различные рецепторы хемокина /хемокины и могут быть завербованы клетками, выделяющими специфические хемокины/хемокиновых рецепторы12. Раковые клетки могут увеличить экспрессию некоторых хемокины для вербовки иммунных клеток, таких какTAMs, регулятивные Т-клетки и миелоидные супрессорные клетки (MDSCs) 6. Блокада специфического хемокина, выделяемого опухолями, может быть многообещающим способом ингибирования проникновения иммунных клеток в опухольную массу.
Здесь мы описываем протокол, который позволяет в пробирке оценки взаимодействия опухолево-макрофагов, используя условные средства из опухолевых клеток, содержащих хемокины и макрофаг клеточные линии.
В этом протоколе есть несколько ключевых шагов: 1) выбор вставки Transwell. Для MV-4-11 клеточной линии, 5 мкм Transwell вставки хорошо работать. Однако, для других клеточных линий, таких как широко используемая линия моноцитов THP-1, другой размер поры может работать лучше. 2) По мере того как по-разному ?…
The authors have nothing to disclose.
Грантовая поддержка: З. Полученная поддержка от Фонда Лимонада Алекса, Американской ассоциации опухолей головного мозга, NIH T32CA108462 и Программы прорывных биомедицинских исследований, которая частично финансируется Фондом Сандлера. В. Вайс был поддержан грантами NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; Сэмюэл Г. Ваксман онкологический фонд; и председатель Эвелин и Мэтти Андерсон.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |