Dit artikel is een nuttige in vitro assay om het vermogen van geconditioneerd medium van tumorcellen te evalueren om macrofagen aan te trekken.
Tumor geassocieerde macrofagen (TAMs) rekening voor een groot percentage van de cellen in de tumor massa voor verschillende soorten kankers. Glioblastoma (GBM), een kwaadaardige hersentumor zonder genezing, heeft tot een halve tumor massa TAMs. TAMs kan Pro-tumoreel of anti-tumoreel zijn, afhankelijk van de activering van specifieke genen in de cellen. Genetische mutaties in de tumoren, door het reguleren van cytokine expressie, kan invloed hebben op de werving van TAMs aan de tumor micro omgeving. Hier beschrijven we een kwantitatieve cel-gebaseerde assay om macrofaag Recruitment te beoordelen door het geconditioneerde medium uit de tumorcellen. Deze test gebruikt de humane macrofaag cellijn MV-4-11 om macrofaag aantrekking te bestuderen door het geconditioneerde medium van glioblastoma, wat een hoge reproduceerbaarheid en een lage variabiliteit mogelijk maakt. Gegevens die met deze test worden gegenereerd, kunnen bijdragen tot een beter begrip van de interactie tussen de tumor en de tumor microomgeving. Vergelijkbare assay kan worden gebruikt voor het beoordelen van de interactie tussen de tumorcellen en andere immuuncellen, met inbegrip van T-cellen en Natural Killer (NK) cellen.
Macrofagen zijn immuuncellen met hoge fenotypische en functionele heterogeniteit1. Ze spelen belangrijke rollen in de host Defense Systems, weefsel reparatie, ontwikkeling en tumorprogressie1. TAMs zijn macrofagen in de micro-omgeving van vaste tumoren. Bepaalde TAMS kan bevorderen tumorgroei door remming van T-cel gemedieerde cytotoxische activiteit, moduleren van de tumor micro Environment (TME), bevordering van angiogenese, invasie en metastase2,3,4, 5. TAMS behoren tot de meest overvloedige celtypen in de TME en een hoger aantal TAMS in het algemeen correleert met een slechtere overleving van de patiënt in vele soorten vaste tumoren6. De verschillende genetische handtekeningen van de tumorcellen beïnvloeden hun vermogen om macrofagen te rekruteren. In GBM, een agressieve hersentumor zonder genezing, macrofagen kunnen vertegenwoordigen tot een helft van de tumor massa7. Co-amplificatie van de epidermale groeifactor receptor (EGFR) en de afkapping Mutant egfrviii wordt vaak waargenomen in GBM, waardoor tumorgroei voordelen8. Cellen die gezamenlijk EGFR en EGFRvIII uitdrukken, trekken meer macrofagen aan dan cellen die EGFR of EGFRvIII afzonderlijk7uitdrukken.
Chemokines zijn een familie van kleine cytokinen die belangrijke rol spelen bij het reguleren van immune samenstelling in de TME6,9. Menselijke cellen Express meer dan 50 cytokines10. Immuun infiltratie in de tumoren wordt grotendeels gerealiseerd door de interactie tussen cytokines en cytokine receptoren11. Elk type immuuncellen spreekt uitgesproken Chemokine receptoren/chemokines en kan worden gerekruteerd door cellen die specifieke chemokines/Chemokine receptoren12afscheidende. Kankercellen kunnen de expressie van bepaalde chemokinen verhogen om immuuncellen te rekruteren, zoals TAMs, regulatoire T-cellen en myeloïde afgeleide suppressor cellen (MDSCs)6. Blokkade van specifieke Chemokine uitgescheiden door de tumoren kan een veelbelovende manier in remming van infiltratie van immune cellen in de tumor massa.
Hier, we beschrijven een protocol dat toelaat in vitro evaluatie van tumor-macrofaag interactie, met behulp van geconditioneerde media uit de tumorcellen met chemokines en macrofaag cellijnen.
In dit protocol zijn er verschillende belangrijke stappen: 1) selectie van de trans well insert. Voor de MV-4-11 cellijn werken 5 μm trans well inserts goed. Voor andere cellijnen zoals de veelgebruikte monocyt cellijn thp-1 kan een andere poriegrootte echter beter werken. 2) omdat verschillende cellijnen met verschillende snelheden groeien, is het belangrijk om het volume van de geconditioneerde media aan te passen aan de celaantallen. Hiertoe kunnen cellen vrije media die onder dezelfde experimentele omstandigheden wo…
The authors have nothing to disclose.
Subsidie ondersteuning: Z. an kreeg steun van Alex’s Lemonade stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 en programma voor baanbrekend biomedisch onderzoek, dat deels wordt gefinancierd door de Sandler Foundation. W. Weiss werd ondersteund door NIH grants R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; de Stichting Samuel G. Waxman Cancer Research; en de Evelyn en Mattie Anderson stoel.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |