Este artigo representa um ensaio in vitro útil para avaliar a capacidade do meio condicionado das células tumorais para atrair macrófagos.
Os macrófagos associados ao tumor (TAMs) respondem por uma grande porcentagem de células na massa tumoral para diferentes tipos de cânceres. Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral maligno sem a cura, tem até uma metade da massa de tumor TAMs. Os TAMs podem ser pró-tumorais ou antitumorais, dependendo da ativação de genes específicos nas células. As mutações genéticas nos tumores, com a expressão de regulação do citocinas, podem afetar o recrutamento de Tams ao microambiente do tumor. Aqui, nós descrevemos um ensaio Cell-Based quantitativo para avaliar o recrutamento do macrófago pelo meio condicionado das pilhas do tumor. Este ensaio utiliza a linhagem celular de macrófago humano MV-4-11 para estudar a atração de macrófago pelo meio condicionado do glioblastoma, permitindo alta reprodutibilidade e baixa variabilidade. Os dados gerados com este ensaio podem contribuir para uma melhor compreensão da interação entre o tumor e o microambiente tumoral. O ensaio similar pode ser usado para avaliar a interação entre as pilhas do tumor e outras pilhas imunes, incluindo pilhas de T e pilhas naturais do assassino (NK).
Os macrófagos são células imunes com alta heterogeneidade fenotípica e funcional1. Desempenham papéis importantes nos sistemas de defesa do hospedeiro, reparação tecidual, desenvolvimento e progressão tumoral1. Os TAMs são macrófagos no microambiente de tumores sólidos. Certos Tams podem promover o crescimento tumoral através da inibição da atividade citotóxica mediada por células T, modulando o microambiente tumoral (TME), promovendo a angiogênese, invasão e metástase2,3,4, 5. os Tams estão entre os tipos os mais abundantes da pilha no TME e um número mais elevado de Tams correlaciona geralmente com a sobrevivência paciente mais má em muitos tipos de tumores contínuos6. As distintas assinaturas genéticas das células tumorais afetam sua capacidade de recrutar macrófagos. Em GBM, um tumor cerebral agressivo sem cura, os macrófagos podem representar até uma metade da massa tumoral7. A co-amplificação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) e seu mutante egfrviii do truncamento são observados freqüentemente em GBM, que confere vantagens do crescimento do tumor8. As células que coexpressam o EGFR e o EGFRvIII atraem mais macrófagos em comparação com células que expressam EGFR ou EGFRvIII isoladamente7.
As quimiocinas são uma família de pequenas citocinas que desempenham papéis significativos na regulação da composição imunológica no TME6,9. As células humanas expressam mais de 50 citocinas10. A infiltração imune nos tumores é amplamente realizada pela interação entre citocinas e receptores de citocina11. Cada tipo de células imunes expressa receptores de quimiocina/quimiocinas distintas e pode ser recrutado por células secretando quimiocinas específicas/receptores de quimiocina12. As células cancerosas podem aumentar a expressão de certas quimiocinas para recrutar células imunes, tais como TAMs, células T reguladoras e células supressoras mielóides derivadas (MDSCs)6. O bloqueio da quimiocina específica secretada pelos tumores pode ser uma forma promissora na inibição da infiltração de células imunes na massa tumoral.
Aqui, nós descrevemos um protocolo que permita in vitro a avaliação da interação do tumor-macrófago, usando meios condicionados das pilhas do tumor que contêm quimiocinas e linhas de pilha do macrófago.
Neste protocolo, existem várias etapas-chave: 1) seleção da inserção Transwell. Para a linha celular MV-4-11, as inserções Transwell de 5 μm funcionam bem. No entanto, para outras linhas celulares, como a linha de células de monócitos comumente usados THP-1, um tamanho de poro diferente pode funcionar melhor. 2) porque as linhas de pilha diferentes crescem em velocidades diferentes, é importante ajustar o volume dos meios condicionados de acordo com números de pilha. Para isso, a mídia sem células incubada …
The authors have nothing to disclose.
Apoio de subvenção: Z. um apoio recebido de Alex ‘ s Lemonade stand Foundation, associação americana de tumores cerebrais, NIH T32CA108462 e programa de pesquisa biomédica Breakthrough, que é parcialmente financiado pela Fundação Sandler. W. Weiss foi apoiado por concessões de NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; a Fundação de pesquisa de câncer de Samuel G. Waxman; e a Evelyn e a cadeira Mattie Anderson.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |