Questo articolo rappresenta un utile saggio in vitro per valutare la capacità del mezzo condizionato dalle cellule tumorali per attirare i macrofagi.
I macrofagi associati al tumore (TAM) rappresentano una grande percentuale di cellule nella massa tumorale per diversi tipi di cancro. Glioblastoma (GBM), un tumore maligno al cervello senza cura, ha fino a metà dei ARM di massa tumorale. I TAM possono essere pro-tumorale o anti-tumorale, a seconda dell’attivazione di geni specifici nelle cellule. Le mutazioni genetiche nei tumori, attraverso la regolazione dell’espressione della citochina, possono influenzare il reclutamento di TAM nel microambiente tumorale. Qui, descriviamo un saggio quantitativo basato sulle cellule per valutare il reclutamento di macrofaci da parte del mezzo condizionato dalle cellule tumorali. Questo analisi utilizza la linea cellulare del macrofago umano MV-4-11 per studiare l’attrazione dei macrofazaggi da parte del mezzo condizionato dal glioblastoma, consentendo un’elevata riproducibilità e bassa variabilità. I dati generati con questo saggio possono contribuire a una migliore comprensione dell’interazione tra il tumore e il microambiente tumorale. Un saggio simile può essere usato per valutare l’interazione tra le cellule tumorali e altre cellule immunitarie, comprese le cellule T e le cellule killer naturali (NK).
I macrofagi sono cellule immunitarie con un’elevata eterogeneità fenotipica e funzionale1. Essi svolgono ruoli importanti nei sistemi di difesa ospite, riparazione dei tessuti, sviluppo e progressione del tumore1. I TAM sono macrofagi nel microambiente dei tumori solidi. Alcuni TAM possono promuovere la crescita tumorale inibendo l’attività citotossica mediata dalle cellule T, modulando il microambiente tumorale (TME), promuovendo l’angiogenesi, l’invasione e la metastasi2,3,4, 5. I TAM sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel TME e un numero più elevato di TAM in genere è correlato alla peggiore sopravvivenza del paziente in molti tipi di tumori solidi6. Le distinte firme genetiche delle cellule tumorali influenzano la loro capacità di reclutare macrofagi. In GBM, un tumore cerebrale aggressivo senza cura, i macrofagi possono rappresentare fino alla metà della massa tumorale7. La coamplificazione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo mutante di troncamento EGFRvIII è frequentemente osservata in GBM, che conferisce vantaggi di crescita tumorale8. Le cellule che coeprimono EGFR ed EGFRvIII attraggono più macrofagi rispetto alle cellule che esprimono EGFR o EGFRvIII da poco.
Le chemiochine sono una famiglia di piccole citochine che svolgono un ruolo significativo nella regolazione della composizione immunitaria nel TME6,9. Le cellule umane esprimono più di 50 citochine10. L’infiltrazione immunitaria nei tumori è in gran parte realizzata dall’interazione tra citochine e recettori citochine11. Ogni tipo di cellule immunitarie esprime recettori chemiochine distinti/ chemiochine e può essere reclutato da cellule che secernono chemiochine specifiche / recettori chemiochine12. Le cellule tumorali possono aumentare l’espressione di alcune chemiochine per reclutare cellule immunitarie come TAM, cellule T regolatorie e cellule soppressori derivate da mieloidi (MDSC)6. Il blocco della chemiochina specifica secreta dai tumori può essere un modo promettente per inibire l’infiltrazione delle cellule immunitarie nella massa del tumore.
Qui, descriviamo un protocollo che consente la valutazione in vitro dell’interazione tumora-macrofago, utilizzando supporti condizionati dalle cellule tumorali contenenti chemiochine e linee cellulari di macrofago.
In questo protocollo, ci sono diversi passaggi chiave: 1) selezione dell’inserto Transwell. Per la linea cellulare MV-4-11, 5 inserti Transwell m funzionano bene. Tuttavia, per altre linee cellulari come la linea cellulare monocito comunemente usata THP-1, una dimensione diversa dei pori potrebbe funzionare meglio. 2) Man mano che linee cellulari diverse crescono a velocità diverse, è importante regolare il volume dei supporti condizionati in base ai numeri di cellulare. A tale scopo, i supporti privi di cellule incuba…
The authors have nothing to disclose.
Grant Support: Un ha ricevuto il sostegno di Alex’s Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 e Program for Breakthrough Biomedical Research, che è parzialmente finanziato dalla Sandler Foundation. W. Weiss è stato supportato da sovvenzioni NIH R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103; la Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; e la sedia Evelyn e Mattie Anderson.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |