Dieser Artikel stellt einen nützlichen In-vitro-Assay dar, um die Fähigkeit des konditionierten Mediums aus Tumorzellen zu bewerten, Makrophagen anzuziehen.
Tumorassoziierte Makrophagen (TAMs) machen einen großen Prozentsatz der Zellen in der Tumormasse für verschiedene Krebsarten aus. Glioblastom (GBM), ein bösartiger Hirntumor ohne Heilung, hat bis zu die Hälfte der Tumormasse TAMs. TAMs können pro-tumoral oder anti-tumoral sein, abhängig von der Aktivierung bestimmter Gene in den Zellen. Genetische Mutationen in den Tumoren können durch die Regulierung der Zytokinexpression die Rekrutierung von TAMs in die Tumormikroumgebung beeinflussen. Hier beschreiben wir einen quantitativen zellbasierten Assay zur Beurteilung der Makrophagenrekrutierung durch das konditionierte Medium aus den Tumorzellen. Dieser Test verwendet die menschliche Makrophagen-Zelllinie MV-4-11, um die Makrophagen-Anziehung durch das konditionierte Medium aus dem Glioblastom zu untersuchen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und geringe Variabilität ermöglicht. Die mit diesem Test generierten Daten können zu einem besseren Verständnis der Wechselwirkung zwischen dem Tumor und der Tumormikroumgebung beitragen. Ähnliche Assay kann verwendet werden, um Interaktion zwischen den Tumorzellen und anderen Immunzellen zu bewerten, einschließlich T-Zellen und natürliche Killerzellen (NK) Zellen.
Makrophagen sind Immunzellen mit hoher phäkotypischer und funktioneller Heterogenität1. Sie spielen eine wichtige Rolle in den Wirtsabwehrsystemen, Gewebereparatur, Entwicklung und Tumorprogression1. TAMs sind Makrophagen in der Mikroumgebung von soliden Tumoren. Bestimmte TAMs können das Tumorwachstum fördern, indem sie t zellvermittelte zytotoxische Aktivität hemmen, die Tumormikroumgebung (TME) modulieren, Angiogenese, Invasion und Metastasierung fördern2,3,4, 5. TAMs gehören zu den häufigsten Zelltypen in der TME und eine höhere Anzahl von TAMs korreliert in der Regel mit schlechteren Patientenüberleben in vielen Arten von soliden Tumoren6. Die ausgeprägten genetischen Signaturen der Tumorzellen beeinflussen ihre Fähigkeit, Makrophagen zu rekrutieren. In GBM, einem aggressiven Hirntumor ohne Heilung, können Makrophagen bis zu der Hälfte der Tumormasse7ausmachen. Die Ko-Amplifikation des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seiner Abschneidemutung EGFRvIII wird häufig bei GBM beobachtet, was Tumorwachstumsvorteile8verleiht. Zellen, die EGFR und EGFRvIII mitexzieren, ziehen mehr Makrophagen an als Zellen, die EGFR oder EGFRvIII singly7exzieren.
Chemokine sind eine Familie von kleinen Zytokinen, die eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Immunzusammensetzung in der TME6,9spielen. Menschliche Zellen exprimieren mehr als 50 Zytokine10. Die Immuninfiltration in den Tumoren wird weitgehend durch die Wechselwirkung zwischen Zytokinen und Zytokinrezeptoren11realisiert. Jede Art von Immunzellen drückt unterschiedliche Chemokinrezeptoren/Chemokine aus und kann von Zellen rekrutiert werden, die bestimmte Chemokine/Chemokin-Rezeptoren sezernieren12. Krebszellen können die Expression bestimmter Chemokine erhöhen, um Immunzellen wie TAMs, regulatorische T-Zellen und myeloiden-abgeleiteten Suppressorzellen (MDSCs) zu rekrutieren6. Die Blockade von spezifischem Chemokin, das von den Tumoren sezerniert wird, kann ein vielversprechender Weg sein, um die Infiltration von Immunzellen in die Tumormasse zu hemmen.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das eine In-vitro-Evaluierung der Tumor-Makrophagen-Interaktion ermöglicht, indem konditionierte Medien aus den Tumorzellen verwendet werden, die Chemokine und Makrophagenzelllinien enthalten.
In diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte: 1) Auswahl der Transwell-Einfügung. Für die Zelllinie MV-4-11 funktionieren 5 m Transwell-Einsätze gut. Bei anderen Zelllinien, wie z. B. der häufig verwendeten Monozytenzelllinie THP-1, kann jedoch eine andere Porengröße besser funktionieren. 2) Da verschiedene Zelllinien mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wachsen, ist es wichtig, die Lautstärke der konditionierten Medien an die Zellenzahlen anzupassen. Dazu können zellfreie Medien, die unter den gleich…
The authors have nothing to disclose.
Grant Support: Z. An received support from Alex es Lemonade Stand Foundation, American Brain Tumor Association, NIH T32CA108462 and Program for Breakthrough Biomedical Research, which is partially funded by the Sandler Foundation. W. Weiss wurde durch NIH-Stipendien R01CA221969, R01NS091620, P50CA097257, U01CA217864, P30CA82103 unterstützt; Die Samuel G. Waxman Cancer Research Foundation; und den Stuhl Evelyn und Mattie Anderson.
0.1 μm filtration cup | Thermo fisher | 566-0010 | |
0.45 μm filter unit | Millipore | SLHA033SS | |
10 mL serological pipettes | Olympus plastics | 12-104 | |
15mL sterile centrifuge tubes | Olympus plastics | 28-103 | |
1 mL pipette tip | ART molecular bioproducts | 2779-RI | |
2 mL aspirating pipet | Falcon | 357558 | |
24-well plate | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
4x lysis buffer | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
5 μm Transwell insert | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
75cm2 flask | Corning | 430641U | |
Accutase | Innovative cell technologies | AT-104 | |
B27 | Gibco | 12587-010 | |
CyQuant Dye | Millipore | ECM507 | Part of ECM507, or can be purchased separately |
DMEM | Gibco | 11965-092 | |
DMEM:F12 | Gibco | 10565-018 | |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
FBS | Gibco | 26140 | |
FGF | Peprotech | 100-18B | |
IMDM | Gibco | 12440-053 | |
PBS | Gibco | 14190-144 | |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
Trypan blue | Biorad | 1450021 |