Bakterilerde Hücre Altı Protein Lokalizasyonu ve Hücre Morfolojisi Değişikliklerini Araştırmak Için Canlı Hücre Floresan Mikroskobu
Summary
Bu makalede, protein subselliyerizasyon dinamiklerini araştırmak ve Bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus’ta yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu kullanarak morfolojik değişiklikleri izlemek için adım adım kılavuz verilmektedir.
Abstract
Bakterilerde hücre bölünmesi ve hücre şeklini etkileyen faktörlerin araştırılması genellikle yüksek çözünürlüklü floresan mikroskobu ile birlikte yapılır, çünkü popülasyon düzeyinde yapılan gözlemler tek bir hücre düzeyinde meydana gelen leri tam olarak yansıtmayabilir. Canlı hücre timelapse mikroskopisi, araştırmacıların hücre bölünmesi veya hücre morfolojisindeki değişiklikleri izlemelerine olanak sağlar ve bu da proteinlerin hücre altı lokalizasyonu ve gen ekspresyonunun zamanlaması ile ilgili değerli içgörüler sağlar, ki bu da önemli biyolojik soruların cevaplanmasında potansiyel olarak yardımcı olur. Burada, bacillus subtilis ve Staphylococcus aureus’taki henotibik değişiklikleri yüksek çözünürlüklü dekonvolution mikroskobu kullanarak izlemek için protokolümüzü açıklıyoruz. Bu raporun amacı, bakterilerin yanı sıra diğer organizmalarda farklı biyolojik süreçleri incelemek için floresan mikroskobu deneyleri yapmak la ilgilenen diğer araştırmacılar tarafından benimsenebilecek basit ve net bir protokol sağlamaktır.
Introduction
Bakteri hücre biyolojisi alanı önemli ölçüde mikroskopi teknikleri son gelişmeler ile geliştirilmiştir1,2. Diğer aletlerin yanı sıra, timelapse floresan mikroskobik deneyler icra edebilen mikroskoplar değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Araştırmacılar gibi floresan proteinler kullanarak gerçek zamanlı olarak çeşitli fizyolojik olayları izleyebilirsiniz, yeşil floresan protein (GFP) tabanlı transkripsiyonel ve çevirisel muhabir füzyon, floresan D-amino asitler (FDAA)3, ya da hücre duvarı, membran ve DNA etiketleme için diğer lekeler kullanın. Bu nedenle floresan mikroskopimikrobiyal hücre biyologları arasında popüler liğini sürdürdüğünü hiç de şaşırtıcı değildir. Sadece son fenotipleri göstermenin yanı sıra, gözlenen fenotiplerin timelapse mikroskobu kullanılarak nasıl ortaya çıkarabileceğine dair bilgi sağlamak bulgulara önemli bir değer katacak ve potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel olarak potansiyel uyuşturucu adayları tarafından hangi hücresel süreçlerin hedeflendiğine dair ipuçları sunabilir4.
Bu makalede, tam motorlu, ters, geniş alan floresan mikroskobu (Malzeme Tablosunabakınız) kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme yapmak için protokoller verilmiştir. Bu protokoller timelapse mikroskoplar yapma yeteneğine sahip diğer floresan mikroskopların ihtiyaçlarına uyacak şekilde uyarlanabilir. Burada tartışılan yazılım, Malzeme Tablosu’ndabelirtildiği gibi üretici tarafından sağlanan özel yazılıma karşılık geliyor olsa da, genellikle diğer mikroskop üreticileri veya serbestçe kullanılabilen ImageJ5tarafından sağlanan yazılım, mikroskopi verilerini analiz etmek için eşdeğer araçlara sahiptir. Zaman aşımının elverişli olmadığı durumlar için, zaman-kurs deneyleri bu makalede açıklandığı şekilde yapılabilir. Burada açıklanan protokoller iki farklı bakteri türündeki henotik değişiklikleri incelemek için ayrıntılı bir kılavuz sağlar: B. subtilis ve S. aureus. Kullanılan suşlar için Tablo 1’e bakınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroskopi mikrobiyal organizmalarla ilgili çalışmalarda dayanak noktası olarak kalmıştır. Mikron ölçekli hücre büyüklükleri göz önüne alındığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar geleneksel olarak elektron mikroskobu (EM) dayanıyordu. EM son yıllarda oldukça güçlü bir teknik haline gelmiş olsa da, sınırlı kullanıcı erişimi16ek olarak kendi içsel sınırlamaları vardır. Floresan mikroskobu tekniklerinde gelişmeler ve FDAA3gibi farkl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Laboratuvar üyelerimize bu yazıdaki yorumları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Güney Florida Üniversitesi’nin (PE) başlangıç ödeneği ile finanse edilmiştir.
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
- Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
- Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
- Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
- Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
- Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
- Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
- Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
- Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
- Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
- Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
- Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
- Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
- Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
- Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
- Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
- Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
- Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).
