Summary

Microscopia a fluorescenza a cellule vive per studiare la localizzazione delle proteine subcellulari e i cambiamenti della morfologia cellulare nei batteri

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Questo articolo fornisce una guida passo-passo per studiare le dinamiche di localizzazione subcellulare delle proteine e per monitorare i cambiamenti morfologici utilizzando la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus.

Abstract

Le indagini sui fattori che influenzano la divisione cellulare e la forma cellulare nei batteri sono comunemente eseguite in combinazione con la microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione, poiché le osservazioni fatte a livello di popolazione potrebbero non riflettere realmente ciò che si verifica a livello di singola cellula. La microscopia a tempo variabile a cellule vive consente agli sperimentatori di monitorare i cambiamenti nella divisione cellulare o nella morfologia cellulare che forniscono preziose informazioni sulla localizzazione subcellulare delle proteine e sulla tempistica dell’espressione genica, come accade, per aiutare potenzialmente a rispondere a importanti domande biologiche. Qui, descriviamo il nostro protocollo per monitorare i cambiamenti fenotipici in Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus utilizzando un microscopio di deconvoluzione ad alta risoluzione. L’obiettivo di questa relazione è quello di fornire un protocollo semplice e chiaro che può essere adottato da altri ricercatori interessati a condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza per studiare diversi processi biologici nei batteri e in altri organismi.

Introduction

Il campo della biologia cellulare batterica è stato notevolmente migliorato dai recenti progressi nelle tecniche di microscopia1,2. Tra gli altri strumenti, i microscopi in grado di condurre esperimenti di microscopia a fluorescenza timelapse rimangono uno strumento prezioso. I ricercatori possono monitorare vari eventi fisiologici in tempo reale utilizzando proteine fluorescenti come le proteine fluorescenti verdi (GFP) e le fusioni di reporter traslazionali, gli amminoacidi D-aminoacidi fluorescenti (FDAA)3o utilizzare altre macchie per etichettare la parete cellulare, la membrana e il DNA. Non sorprende quindi che la microscopia a fluorescenza rimanga popolare tra i biologi delle cellule microbiche. Oltre a mostrare semplicemente i fenotipi finali, fornire informazioni su come i fenotipi osservati nascono utilizzando la microscopia timelapse potrebbe aggiungere un valore significativo ai risultati e potenzialmente offrire indizi su quali processi cellulari sono presi di mira da potenziali candidati alla droga4.

I protocolli per condurre l’imaging ad alta risoluzione utilizzando un microscopio a fluorescenza a campo largo completamente motorizzato, invertito e a campo largo (vedi tabella dei materiali)sono forniti in questo articolo. Questi protocolli potrebbero essere adattati alle esigenze di altri microscopi a fluorescenza in grado di condurre la microscopia timelapse. Anche se il software qui discusso corrisponde allo specifico software fornito dal produttore come indicato nella Tabella dei Materiali, il software comunemente fornito da altri produttori di microscopi o il ModelloImmagineJ 5liberamente disponibile, dispone di strumenti equivalenti per l’analisi dei dati di microscopia. Per le condizioni in cui il timelapse non è favorevole, gli esperimenti di ciclo temporale potrebbero essere condotti come descritto in questo articolo. I protocolli qui descritti forniscono una guida dettagliata per studiare i cambiamenti fenotipici in due diverse specie batteriche: B. subtilis e S. aureus. Vedere la Tabella 1 per i ceppi utilizzati.

Protocol

1. Condizioni generali di crescita Inoculare 2 mL di mezzo di crescita appropriato integrato con antibiotici (dove richiesto) con una singola colonia del ceppo (s) da immaginare. Incubare queste colture di semi durante la notte a 22 gradi centigradi in un incubatore agitazione.NOTA: Le condizioni specifiche di crescita batterica utilizzate in questo articolo sono fornite nella sezione dei risultati rappresentativi. Diluire le colture durante la notte 1:20 in supporti freschi in un flacone da 125 m…

Representative Results

Fenotipi GpsBIn precedenza abbiamo dimostrato che Sa-GpsB è una proteina essenziale come esaurimento di GpsB utilizzando un RNA antisenso risultati in lisi cellulare9. Qui descriviamo come l’emergere di vari fenotipi della divisione cellulare e i cambiamenti nella localizzazione delle proteine potrebbero essere catturati utilizzando il protocollo di microscopia timelapse descritto in questo articolo. A questo scopo, S. aureus sforza RB143 [SH1000 che ospita pEPSA5 (v…

Discussion

La microscopia è rimasta un pilastro negli studi relativi agli organismi microbici. Data la loro dimensione cellulare su scala micron, gli studi a livello di cellula singola si sono tradizionalmente basati sulla microscopia elettronica (EM). Sebbene EM sia diventata una tecnica piuttosto potente negli ultimi anni, ha i suoi limiti intrinseci oltre al limitato accesso degli utenti16. I miglioramenti nelle tecniche di microscopia a fluorescenza e lo sviluppo di diverse sonde fluorescenti, come FDAA…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i nostri membri del laboratorio per i loro commenti su questo articolo. Questo lavoro è stato finanziato da una start-up della University of South Florida (PE).

Materials

Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade – Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

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Cite This Article
Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

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