細菌における細胞内タンパク質の局在化と細胞形態の変化を調べる生細胞蛍光顕微鏡
Summary
この記事では、タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを調査し、バチルス・サチリスおよび黄色ブドウ球菌における高分解能蛍光顕微鏡を用いて形態学的変化を監視するためのステップバイステップガイドを提供します。
Abstract
細菌の細胞分裂および細胞形状に影響を与える因子の調査は、集団レベルで行われた観察が単一細胞レベルで起こることを本当に反映していない可能性があるため、一般的に高分解能蛍光顕微鏡と組み合わせて行われる。生細胞タイムラプス顕微鏡検査により、研究者は細胞分裂または細胞形態の変化を監視することができ、タンパク質の細胞内局在化や遺伝子発現のタイミングに関する貴重な洞察を提供し、重要な生物学的質問に答えるのに役立つ可能性があります。ここでは、高分解能デコンボリューション顕微鏡を用いて、バチルス・サチリスと黄色ブドウ球菌の表現型変化をモニタリングするプロトコルについて説明する。本報告書の目的は、細菌や他の生物の異なる生物学的過程を研究するために蛍光顕微鏡実験を行うことに興味を持つ他の研究者が採用できる、シンプルで明確なプロトコルを提供することである。
Introduction
細菌細胞生物学の分野は、顕微鏡技術1、2の最近の進歩によって有意に増強された。他の器械の間で、タイムラプス蛍光顕微鏡実験を行うことができる顕微鏡は貴重な用具のままである。研究者は、緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースの転写および翻訳レポーター融合、蛍光D-アミノ酸(FDAA)3、または細胞壁、膜およびDNAを標識するための他の染色を使用して、蛍光タンパク質を使用してリアルタイムで様々な生理学的事象を監視することができます。したがって、微生物細胞生物学者の間で蛍光顕微鏡が依然として普及しているのは驚くべきことではない。単に末端表現型を示すことに加えて、タイムラプス顕微鏡を用いて観察された表現型がどのように生じるかについての情報を提供することは、所見に大きな価値を加え、潜在的な薬物候補によって標的とされている細胞プロセスに関する手がかりを提供する可能性がある4.
この記事では、完全に電動、反転、広視野蛍光顕微鏡(材料表参照)を用いて高解像度イメージングを行うプロトコルを提供します。これらのプロトコルは、タイムラプス顕微鏡を行うことができる他の蛍光顕微鏡のニーズに合わせて適合させることができる。ここで説明するソフトウェアは、材料の表に示されている特定の製造元が提供するソフトウェアに対応していますが、他の顕微鏡メーカーまたは自由に入手可能な ImageJ5によって一般的に提供されるソフトウェアには、顕微鏡データを分析するための同等のツールがあります。タイムラプスが役に立たない場合は、この記事の説明に従って、タイムコース実験を行うことができる。ここで説明するプロトコルは、2つの異なる細菌種の表現型変化を研究するための詳細なガイドを提供する:B.サチリスとS.アウレウス。使用するひずみについては、表 1 を参照してください。
Protocol
Representative Results
Discussion
顕微鏡検査は、微生物に関する研究において主力であり続けています。ミクロンスケールの細胞サイズを考えると、単細胞レベルの研究は従来、電子顕微鏡(EM)に依存してきました。EMは近年非常に強力な技術となっていますが、限られたユーザーアクセス16に加えて、独自の本質的な制限があります。蛍光顕微鏡技術の改良とFDAA3のような異なる蛍光プロー…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この記事に関するコメントをラボメンバーに感謝します。この作品は、サウスフロリダ大学(PE)からのスタートアップ助成金によって資金提供されました。
Materials
| Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
| FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
| Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
| IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
| PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
| SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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