이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.
박테리아에 있는 세포 분열 그리고 세포 모양에 영향을 미치는 요인의 조사는 인구 수준에서 행해진 관측이 진정으로 단 하나 세포 수준에서 일어나는 무슨을 반영하지 않을 수 있기 때문에 고해상도 형광 현미경 검사법과 함께 일반적으로 수행됩니다. 살아있는 세포 시간 경과 현미경 검사법은 잠재적으로 중요한 생물학 질문에 대답하는 것을 돕기 위하여, 일어나는 단백질의 세포 외 현지화 및 유전자 발현의 타이밍에 관하여 귀중한 통찰력을 제공하는 세포 분열 또는 세포 형태학에 있는 변경을 감시하는 것을 허용합니다. 여기에서, 우리는 고해상도 데콘볼루션 현미경을 사용하여 바실러스 subtilis 및 황색포도상구균에 있는 표현형 변경을 감시하기 위하여 우리의 프로토콜을 기술합니다. 이 보고서의 목적은 박테리아뿐만 아니라 다른 유기체에서 다른 생물학적 과정을 연구하기 위해 형광 현미경 실험을 수행에 관심이다른 조사자에 의해 채택 될 수있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.
세균성 세포 생물학의 필드는 현미경 기술1,2에있는 최근 발전에 의해 현저하게 향상되었습니다. 다른 기기 들 중에서도 타임랩스 형광 현미경 실험을 수행할 수 있는 현미경은 여전히 귀중한 도구입니다. 연구원은 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 전사 및 번역 기자 융합, 형광 D 아미노산 (FDAA)3,또는 세포벽, 막 및 DNA를 라벨링하기 위한 다른 얼룩을 사용하여 다양한 생리적 사건을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 형광 현미경 검사법은 미생물 세포 생물학자 중 인기를 유지하는 것은 놀라운 일이 아닙니다. 단순히 말기 표현형을 보여주는 것 이외에, 타임랩스 현미경을 사용하여 관찰된 표현형이 어떻게 발생하는지에 대한 정보를 제공하는 것은 연구 결과에 상당한 가치를 더할 수 있으며 잠재적으로 어떤 세포 과정이 잠재적 약물 후보에 의해 표적으로 되고 있는지에 대한 단서를 제공할 수 있다4.
완전 전동, 반전, 광시야 형광 현미경을 사용하여 고해상도 이미징을 수행하는 프로토콜(재료 표참조)이 이 문서에서 제공됩니다. 이 프로토콜은 타임랩스 현미경을 수행할 수 있는 그밖 형광 현미경의 필요에 맞게 적응될 수 있었습니다. 여기에 설명된 소프트웨어는 재료 표에표시된 특정 제조업체 제공 소프트웨어에 해당하지만 일반적으로 다른 현미경 제조업체 또는 자유롭게 사용할 수 있는 ImageJ5에서제공하는 소프트웨어에는 현미경 데이터를 분석하는 동등한 도구가 있습니다. 타임랩스가 도움이 되지 않는 조건의 경우 이 문서에서 설명한 대로 시간 코스 실험을 수행할 수 있습니다. 여기에서 기술된 프로토콜은 2개의 다른 세균성 종에 있는 표현형 변경을 공부하기 위하여 상세한 가이드를 제공합니다: B. subtilis 및 S. 아우레우스. 사용되는 균주에 대한 표 1을 참조하십시오.
현미경 검사법은 미생물 유기체에 관련된 연구 결과에 있는 주류를 남아 있습니다. 그들의 미크론 규모 세포 크기를 감안할 때, 단세포 수준 연구 결과는 전통적으로 전자 현미경 검사법 (EM)에 의존했습니다. EM은 최근 몇 년 동안 매우 강력한 기술이되었지만 제한된 사용자 액세스16외에도 고유의 고유한 제한 사항이 있습니다. 형광 현미경 기술의 개선과 FDAA3와</sup…
The authors have nothing to disclose.
이 문서에 대한 의견에 대해 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 작품은 사우스 플로리다 대학에서 창업 보조금에 의해 투자되었다 (PE).
Agarose | Fisher BioReagents | BP160-100 | Molecular Biology Grade – Low EEO |
DAPI | Invitrogen | D3571 | Microscopy |
FM4-64 | Invitrogen | T3166 | Microscopy |
Glass bottom dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | Microscopy |
IPTG | Fisher BioReagents | BP1755-10 | Dioxane-free |
Microscope | GE | DeltaVision Elite | Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque. |
PC190723 | MilliporeSigma | 3445805MG | FtsZ inhibitor |
SoftWorx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |