Summary

المجهرية الخلوية التفاعلية للتحقيق في توطين البروتين تحت الخلوي والتغيرات في الخلايا المورفولوجية في البكتيريا

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

توفر هذه المقالة دليل خطوه بخطوه للتحقيق في ديناميات التعريب الخلوية البروتينية ومراقبه التغييرات المورفولوجية باستخدام المجهر عالي الدقة الفلورية في العصي الفرعية والمكورات العنقودية الذهبية.

Abstract

وعاده ما يتم اجراء التحقيقات في العوامل التي تؤثر علي انقسام الخلايا وشكل الخلية في البكتيريا بالاقتران مع المجهر الفلوري عالي الدقة حيث ان الملاحظات التي تتم علي مستوي السكان قد لا تعكس حقا ما يحدث علي مستوي خليه واحده. يسمح المجهر الزمني للخلايا الحية للمحققين بمراقبه التغيرات في انقسام الخلايا أو الشكل الخلوي الذي يوفر رؤى قيمه فيما يتعلق بالتوطين دون الخلوي للبروتينات وتوقيت التعبير الجيني ، كما يحدث ، للمساعدة المحتملة في الاجابه علي الاسئله البيولوجية الهامه. هنا ، ونحن وصف البروتوكول لدينا لرصد التغيرات الظاهرية في عصيه سوتيلليس والمكورات العنقودية الذهبية باستخدام المجهر عاليه الدقة تفكيك. والهدف من هذا التقرير هو توفير بروتوكول بسيط وواضح يمكن ان يعتمده المحققون الآخرون المهتمون باجراء تجارب المجهر الفلوري لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة في البكتيريا وكذلك الكائنات الحية الأخرى.

Introduction

وقد تم تعزيز مجال بيولوجيا الخلايا البكتيرية بشكل كبير من خلالالتطورات الاخيره في تقنياتالمجهر 1,2. ومن بين الاداات الأخرى ، تظل المجاهر القادرة علي اجراء تجارب المجهر الضوئي المضفية الزمنيه وسيله قيمه. ولذلك فمن غير المستغرب ان المجهر الفلوري لا تزال شعبيه بين علماء البيولوجيا الخلايا الميكروبية. الاضافه إلى إظهار الأنماط الظاهرية النهائية ، فان تقديم معلومات عن كيفيه ظهور الأنماط الظاهرية الملحوظة باستخدام المجهر الزمني يمكن ان يضيف قيمه كبيره إلى النتائج ويحتمل ان يقدم أدله عن العمليات الخلوية التي تستهدفها المرشحات المحتملات للادويه4.

يتم توفير البروتوكولات لاجراء التصوير عاليه الدقة باستخدام الميكانيكية بالبالكامل ، مقلوب ، والمجهر فلوري واسعه المجال (انظر جدول المواد) في هذه المقالة. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات لتتناسب مع احتياجات المجاهر الأخرى التي هي قادره علي اجراء المجهر الزمني. علي الرغم من ان البرنامج الذي تمت مناقشته هنا يتوافق مع البرامج المحددة التي توفرها الشركة المصنعة كما هو مبين في جدول المواد، والبرمجيات التي يتم توفيرها عاده من قبل مصنعي المجهر الآخرين أو imagej5المتوفرة بحريه ، لديها أدوات مكافئه لتحليل بيانات المجهر. النسبة للظروف التي لا يكون فيها الزمن الزمني مواتيا ، يمكن اجراء تجارب الدورات الدراسية علي النحو الموصوف في هذه المادة. وتوفر البروتوكولات الموصوفة هنا دليلا مفصلا لدراسة التغيرات في النمط الظاهري في نوعين بكتيريين مختلفين: b. رقيقه و s. الذهبية . انظر الجدول 1 للحصول علي السلالات المستخدمة.

Protocol

1-ظروف النمو العامة تطعيم 2 مل من متوسط النمو المناسب تستكمل مع المضادات الحيوية (عند الاقتضاء) مع مستعمره واحده من سلاله (ق) ان يكون المصابين بالإجهاد. احتضان هذه الثقافات البذور بين عشيه وضحيها في 22 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز.ملاحظه: يتم توفير شروط النمو البكتيرية المحددة المستخد…

Representative Results

الأنماط الظاهرية GpsBسابقا لقد أظهرنا ان Sa-GpsB هو بروتين أساسي كما استنفاد GpsB باستخدام النتائج الحمض الريبي النيبالي انتيسنس في الخلية تحلل9. هنا نوضح كيف يمكن التقاط ظهور مختلف الأنماط الظاهرية لتقسيم الخلايا والتغيرات في توطين البروتين باستخدام بروتوكول المجهر ال…

Discussion

وظل المجهر عمادا في الدراسات المتعلقة بالكائنات الميكروبية. النظر إلى حجم خلايا الميكرون ، فان الدراسات علي مستوي الخلية الواحدة تعتمد تقليديا علي المجهر الكتروني (EM). علي الرغم من ان EM أصبحت تقنيه قويه جدا في السنوات الاخيره ، فان لديها حدودها الذاتية الخاصة بالاضافه إلى وصول المستخدم مح…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر أعضاء المعمل علي تعليقاتهم علي هذه المقالة. وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحه لبدء التشغيل من جامعه جنوب فلوريدا (PE).

Materials

Agarose Fisher BioReagents BP160-100 Molecular Biology Grade – Low EEO
DAPI Invitrogen D3571 Microscopy
FM4-64 Invitrogen T3166 Microscopy
Glass bottom dish MatTek P35G-1.5-14-C Microscopy
IPTG Fisher BioReagents BP1755-10 Dioxane-free
Microscope GE DeltaVision Elite Customized Olympus IX-71 Inverted Microscope Stand; Custom Illumination Tower and Transmitted Light Illuminator Module. Objectives: PLAPON 60X (N.A. 1.42, WD 0.15 mm); OLY 100X OIL (N.A. 1.4, WD 0.12 mm); DIC Prism Nomarski for 100X Objective; CoolSnap HQ2 camera; SSI Assembly 7-color; Environmental control chamber – opaque.
PC190723 MilliporeSigma 3445805MG FtsZ inhibitor
SoftWorx GE Manufacturer-supplied imaging software

References

  1. Coltharp, C., Xiao, J. Superresolution microscopy for microbiology. Cellular Microbiology. 14 (12), 1808-1818 (2012).
  2. Holden, S. Probing the mechanistic principles of bacterial cell division with super-resolution microscopy. Current Opinion in Microbiology. 43, 84-91 (2018).
  3. Hsu, Y. P., et al. Full color palette of fluorescent d-amino acids for in situ labeling of bacterial cell walls. Chemical Science. 8 (9), 6313-6321 (2017).
  4. Nonejuie, P., Burkart, M., Pogliano, K., Pogliano, J. Bacterial cytological profiling rapidly identifies the cellular pathways targeted by antibacterial molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (40), 16169-16174 (2013).
  5. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BioMed Central Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  6. Colville, K., Tompkins, N., Rutenberg, A. D., Jericho, M. H. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria. Langmuir. 26 (4), 2639-2644 (2010).
  7. McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19 (3), 373-385 (1999).
  8. Wallace, W., Schaefer, L. H., Swedlow, J. R. A workingperson’s guide to deconvolution in light microscopy. Biotechniques. 31 (5), 1076-1082 (2001).
  9. Eswara, P. J., et al. An essential Staphylococcus aureus cell division protein directly regulates FtsZ dynamics. Elife. 7, (2018).
  10. Haeusser, D. P., Margolin, W. Splitsville: structural and functional insights into the dynamic bacterial Z ring. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 305-319 (2016).
  11. Du, S., Lutkenhaus, J. At the Heart of Bacterial Cytokinesis: The Z Ring. Trends in microbiology. , (2019).
  12. Haranahalli, K., Tong, S., Ojima, I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 24 (24), 6354-6369 (2016).
  13. Brzozowski, R. S., et al. Deciphering the Role of a SLOG Superfamily Protein YpsA in Gram-Positive Bacteria. Frontiers in Microbiology. 10, 623 (2019).
  14. Elsen, N. L., et al. Mechanism of action of the cell-division inhibitor PC190723: modulation of FtsZ assembly cooperativity. Journal of the American Chemical Society. 134 (30), 12342-12345 (2012).
  15. Haydon, D. J., et al. An inhibitor of FtsZ with potent and selective anti-staphylococcal activity. Science. 321 (5896), 1673-1675 (2008).
  16. Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Jensen, G. J. Bacterial TEM: new insights from cryo-microscopy. Methods in Cell Biology. 96, 21-45 (2010).
  17. Ni, Q., Mehta, S., Zhang, J. Live-cell imaging of cell signaling using genetically encoded fluorescent reporters. Federation of European Biochemical Societies Journal. 285 (2), 203-219 (2018).
  18. Weiss, C. A., Hoberg, J. A., Liu, K., Tu, B. P., Winkler, W. C. Single-Cell Microscopy Reveals That Levels of Cyclic di-GMP Vary among Bacillus subtilis Subpopulations. Journal of Bacteriology. 201 (16), (2019).
  19. Schneider, J. P., Basler, M. Shedding light on biology of bacterial cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1707), (2016).
  20. Yao, Z., Carballido-Lopez, R. Fluorescence imaging for bacterial cell biology: from localization to dynamics, from ensembles to single molecules. Annual review of microbiology. 68, 459-476 (2014).
  21. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  22. Fredborg, M., et al. Automated image analysis for quantification of filamentous bacteria. BioMed Central Microbiology. 15, 255 (2015).
  23. Ursell, T., et al. precise quantification of bacterial cellular dimensions across a genomic-scale knockout library. BioMed Central Biology. 15 (1), 17 (2017).

Play Video

Cite This Article
Brzozowski, R. S., White, M. L., Eswara, P. J. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (153), e59905, doi:10.3791/59905 (2019).

View Video