Bu yöntemin amacı, memeli tümör hücrelerini floresan etiketli kan damarlarıolan zebra balığı embriyosuna xenografting ederek tümör anjiyogenezinin in vivo modelini oluşturmaktır. Ksenogreft ve ilişkili damarların görüntülenmesiyle anjiyojenik yanıtın kantitatif ölçümü elde edilebilir.
Tümör anjiyogenez anti-kanser tedavisinin önemli bir hedefi dir ve bu yöntem in vivo bu süreci incelemek için yeni bir model sağlamak için geliştirilmiştir. Bir zebrabalığı ksenograft iki gün-post-fertilizasyon zebrabalığı embriyolarının perivitellin uzayına memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulur, iki güne kadar deneysel bir bitiş noktasında gözlenen anjiyojenik yanıtın derecesini ölçme takip implantasyon sonrası. Bu yöntemin en önemli avantajı, zebra balığının grefte anjiyojenik yanıtı doğru bir şekilde belirleyebilme yeteneğidir. Bu, moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesini ve anjiyojenik yanıta konak vs tümör katkısının incelenmesini sağlar. Ksenogreftli embriyolar, tümör anjiyogenezi inhibe etme stratejilerini araştırmak için potansiyel anti-anjiyogenez ilaçları ile kuluçka gibi çeşitli tedavilere tabi tutulabilir. Anjiyojenik yanıt da daha dinamik hücresel süreçleri incelemek için canlı görüntülenebilir. Nispeten talepsiz deneysel teknik, zebra balığının ucuz bakım maliyetleri ve kısa deneysel zaman çizelgesi bu modeli tümör anjiyogenezi manipüle etme stratejilerinin geliştirilmesi için özellikle yararlı hale getirmektedir.
Anjiyogenez kanserin klasik özelliklerinden biridir ve anti-kanser tedavisinin bir hedef temsil eder1,2. Bu süreci incelemek için, kanser ksenogreft modelleri fareler gibi hayvanlara memeli tümör hücreleri implante tarafından oluşturulmuştur3. Bir zebrabalığı ksenogreft modeli de geliştirilmiştir, hangi içine tümör hücrelerinin implantasyonu içerir 2 gün sonrası döllenme (dpi) zebra balığı içine zebrabalığı kan damarlarının hızlı büyüme ile sonuçlanır4.
Bu protokol, anjiyojenik yanıtın tüm ksenogreft boyunca doğru bir şekilde ölçülebileceği in vivo zebrabalığı embriyo tümör ksenogreft modelini tanımlar. Bu yöntem araştırmacı, in vivo, tümör anjiyojenik yanıtı destekleyen moleküler mekanizmaları incelemek için izin verir. Zebra balığının genetik sistemlenebilirliği konak katkısının sorgulanmasını sağlarken, farklı tümör hücre hatlarının seçilmesi tümör katkısının anjiyogeneze katkısının da incelenmesini sağlar5,6,7. Buna ek olarak, zebra balığı larvaları küçük moleküllere geçirgen olduğundan, spesifik yol inhibitörleri kullanılabilir veya ilaç kütüphaneleri tümör anjiyogenezinin yeni inhibitörlerini belirlemek için taranabilir8,9,10, 11. Yıl.
Zebrabalığı embriyo ksenograft modeli diğer memeli ksenogreft modellerine göre benzersiz avantajlar sunar. Zebrabalığı ksenogreftleri daha ucuz ve daha kolay yapılır, çok sayıda hayvan incelenebilirve canlı hücre görüntüleme hücre davranışının detaylı incelenmesine olanak sağlar 4. Önemli damar büyümesini gözlemlemek için birkaç haftaya kadar gerektiren diğer in vivo modellerinaksine, zebrabalığı ksenogreftlerinde anjiyogenez implantasyon dan sonra 24 saat içinde görülebilir3,4. Ancak, embriyonik zebra balığında adaptif bir bağışıklık sisteminin olmaması, ksenogreftin sürdürülmesinde yararlı olmakla birlikte, adaptif immün yanıtın ve tümör anjiyogenezine olan katkısının incelenemeyeceği anlamına gelir. Buna ek olarak, tümör stromal hücrelerinin eksikliği, ortokik olarak tümörün implante edilememesi ve zebra balığı ile memeli hücreleri arasındaki bakım sıcaklığı farkı bu yöntemin potansiyel zayıflıklarıdır. Bununla birlikte, canlı görüntüleme için bu modelin amenability ve doğru anjiyojenik yanıtı quantitate yeteneği in vivo tümör anjiyogenezdüzenleyen hücresel süreçleri incelemek için benzersiz yararlı hale getirir.
Protokoldeki ilk kritik adım tümör hücrelerinin implantasyonudur. Hücrelerin, ksenogreftin embriyo ödem yapmadan embriyoya başarılı bir şekilde implant atmasını sağlayacak bir yere enjekte edilmesi esastır. Çok anterior bir enjeksiyon hücrelerin kalbe doğru hareket izin verebilir, kan dolaşımını engelleyen ve ödem yol açan, çok posterior bir enjeksiyon kötü implante ksenogreft neden olurken. Bir anterior enjeksiyon en iyi o enjekte olarak kalpten uzağa işaret ediyor, böylece arka yönde bir ?…
The authors have nothing to disclose.
Auckland Üniversitesi zebra balığı tesisini ve Auckland Tıp Bilimleri Fakültesi Biyomedikal Görüntüleme Araştırma Birimi’ni yönettiği için Bay Alhad Mahagaonkar’a zaman atlamalı konfokal mikroskopi konusunda yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Yeni Zelanda Sağlık Araştırma Konseyi proje hibesi (14/105), Yeni Zelanda Kraliyet Derneği Marsden Fonu Proje Hibesi (UOA1602) ve J.W.A.’ya verilen Auckland Medical Research Foundation Project Grant (1116012) tarafından desteklenmiştir.
Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |