في التصوير في الجسم الحي وتكميم الاستجابة الوعائية المضيف في ورم حمار وحشي Xenografts
Summary
والهدف من هذه الطريقة هو توليد نموذج في الجسم الحي من تكوين الأوعية الدموية الورم عن طريق xenografting الخلايا السرطانية الثدييات في جنين حمار وحشي الذي لديه الأوعية الدموية ذات العلامات الفلورية. من خلال تصوير xenograft والأوعية المرتبطة بها، يمكن الحصول على قياس كمي للاستجابة الوعائية.
Abstract
تكوين الأوعية الدموية الورم هو الهدف الرئيسي للعلاج المضاد للسرطان وقد تم تطوير هذه الطريقة لتوفير نموذج جديد لدراسة هذه العملية في الجسم الحي. يتم إنشاء xenograft حمار وحشي عن طريق زرع خلايا ورم الثدييات في الفضاء المحيطي من يومين بعد الإخصاب الأجنة حمار وحشي، تليها قياس مدى الاستجابة الوعائية التي لوحظت في نقطة نهاية تجريبية تصل إلى يومين ما بعد الزرع. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي القدرة على تكميم بدقة في حمار وحشي المضيف استجابة وعائية إلى الكسب غير المشروع. وهذا يتيح الفحص التفصيلي للآليات الجزيئية وكذلك مساهمة المضيف مقابل الورم في الاستجابة الوعائية. يمكن أن تخضع الأجنة المطعّمة من xenografted لمجموعة متنوعة من العلاجات، مثل الحضانة مع الأدوية المحتملة المضادة للأوعية الدموية، من أجل التحقيق في استراتيجيات لمنع تكوين الأوعية الدموية الورم. يمكن أيضًا تصوير الاستجابة الوعائية بشكل مباشر من أجل فحص العمليات الخلوية الأكثر ديناميكية. التقنية التجريبية التي لا تتطلب الكثير نسبيا، وتكاليف الصيانة الرخيصة لسمك الحمار الوحشي والجدول الزمني التجريبي القصير تجعل هذا النموذج مفيدا بشكل خاص لتطوير استراتيجيات للتعامل مع تكوين الأوعية الدموية الورم.
Introduction
تكوين الأوعية الدموية هو واحد من السمات الكلاسيكية للسرطان ويمثل هدفا للعلاج المضاد للسرطان1،2. لدراسة هذه العملية ، تم إنشاء نماذج xenograft من السرطان عن طريق زرع خلايا أورام الثدييات في الحيوانات مثل الفئران3. كما تم تطوير نموذج xenograft حمار وحشي، والذي ينطوي على زرع الخلايا السرطانية في 2 أيام بعد الإخصاب (نقطة في البوصة) حمار وحشي مما يؤدي إلى النمو السريع للأوعية الدموية حمار وحشي في xenograft4.
يصف هذا البروتوكول نموذج ورم الجنين في الجسم الوحشي الذي يمكن فيه تحديد الاستجابة الوعائية بدقة عبر الجرافوجرافة بأكملها. تسمح هذه الطريقة للمحقق بفحص الآليات الجزيئية التي تدعم الاستجابة الوعائية للورم في الجسم الحي. تسمح القدرة الوراثية لسمك الحمار الوحشي باستجواب مساهمة المضيف، في حين يسمح اختيار خطوط الخلايا السرطانية المختلفة بشفية الورم في تكوين الأوعية الدموية لفحصها أيضًا5و6و7. وبالإضافة إلى ذلك، كما يرقات حمار وحشي قابلة للنفاذ إلى جزيئات صغيرة، يمكن استخدام مثبطات مسار محددة أو يمكن فحص مكتبات المخدرات لتحديد مثبطات جديدة من تكوين الأوعية الدموية الورم8،9،10، 11.
نموذج xenograft الجنين حمار وحشي يقدم مزايا فريدة من نوعها بالمقارنة مع نماذج xenograft الثدييات الأخرى. حمار وحشي xenografts أرخص وأسهل لأداء، ويمكن فحص أعداد كبيرة من الحيوانات والتصوير بالخلايا الحية يسمح بفحص مفصل لسلوك الخلية4. خلافا لغيرها من النماذج في الجسم الحي، والتي تتطلب ما يصل إلى عدة أسابيع لمراقبة نمو كبير في الأوعية، يمكن ملاحظة تكوين الأوعية الدموية في xenografts حمار وحشي في غضون 24 ساعة بعد زرع3،4. ومع ذلك، فإن عدم وجود نظام مناعي متكيف في سمك الحمار الوحشي الجنيني، في حين أن مفيدة للحفاظ على xenograft، يعني أنه لا يمكن فحص الاستجابة المناعية التكيفية ومساهمتها في تكوين الأوعية الدموية الورم. وبالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود الخلايا السترومالالورمية ، وعدم القدرة على زرع الورم بشكل أورثوموضعي ، والفرق في درجة حرارة الصيانة بين حمار وحشي وخلايا الثدييات هي نقاط الضعف المحتملة لهذه الطريقة. ومع ذلك، فإن إمكانية إنشاء هذا النموذج للتصوير الحي والقدرة على تحديد الكمية بدقة للاستجابة الوعائية يجعلها مفيدة بشكل فريد لدراسة العمليات الخلوية التي تنظم تكوين الأوعية الدموية الورم في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوة الحرجة الأولى في البروتوكول هي زرع الخلايا السرطانية. من الضروري أن يتم حقن الخلايا في موقع من شأنه أن يسمح للxenograft لزرع بنجاح في الجنين دون جعل وذمة الجنين. يمكن أن تسمح الحقنالأمامية جداً للخلايا بالتحرك نحو القلب، وسد مجرى الدم ويؤدي إلى وذمة، في حين أن الحقن الذي هو الخلفي جداً س…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر السيد الحاج ماهاجونكار على إدارته مرفق أسماك الحمار الوحشي بجامعة أوكلاند ووحدة أبحاث التصوير الطبي الحيوي، كلية العلوم الطبية، جامعة أوكلاند، على مساعدتهم في الفحص المجهري البؤري الفاصل زمنياً. وقد دعم هذا العمل منحة من مجلس البحوث الصحية في نيوزيلندا (14/105)، ومنحة مشروع صندوق الجمعية الملكية النيوزيلندية مارسدن (UOA1602)، ومنحة مشروع مؤسسة أوكلاند للبحوث الطبية (1116012) مُنحت إلى شركة J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
