Цель этого метода состоит в том, чтобы создать модель in vivo опухолевого ангиогенеза путем ксенотрансплантации опухолевых клеток млекопитающих в эмбрион зебры, который имеет флуоресцентно обозначенные кровеносные сосуды. С помощью изображения ксенотранспланта и связанных с ним сосудов можно получить количественное измерение ангиогенной реакции.
Опухолевой ангиогенез является ключевой целью противораковой терапии, и этот метод был разработан, чтобы обеспечить новую модель для изучения этого процесса in vivo. Ксенотрансплантат зебры создается путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в перивительное пространство двухдневных эмбрионов зебры, а затем измерения степени ангиогенной реакции, наблюдаемой в экспериментальной точке конца до двух дней после имплантации. Ключевым преимуществом этого метода является способность точно квантитаризировать ангиогенную реакцию зебры-хозяина на трансплантат. Это позволяет детально изучить молекулярные механизмы, а также вклад хозяина против опухоли в ангиогенный ответ. Ксенотрансвированные эмбрионы могут подвергаться различным методам лечения, таким как инкубация с потенциальными антиангиогенезными препаратами, для того, чтобы исследовать стратегии по ингибированию опухолевого ангиогенеза. Ангиогенный ответ также может быть живым изображением для того, чтобы изучить более динамичные клеточные процессы. Относительно нетребовательная экспериментальная техника, дешевые затраты на техническое обслуживание зебры и короткие экспериментальные сроки делают эту модель особенно полезной для разработки стратегий по манипулированию опухолевым ангиогенезом.
Ангиогенез является одним из классических признаков рака и представляет собой цель противораковой терапии1,2. Для изучения этого процесса, ксенотрансплантат модели рака были созданы путем имплантации опухолевых клеток млекопитающих в животных, таких как мыши3. Модель ксенотранспланта зебры также была разработана, которая включает в себя имплантацию опухолевых клеток в 2 дня после оплодотворения (dpi) зебры, что приводит к быстрому росту кровеносных сосудов зебры в ксенотрансвграф4.
Этот протокол описывает in vivo зебрафиш эмбриона опухоли ксенотрансплантат модели, в которой ангиогенный ответ может быть точно количественно по всему ксенотрансвграф. Этот метод позволяет исследователю изучить, in vivo, молекулярные механизмы, которые лежат в основе опухоли ангиогенной реакции. Генетическая tractability зебры позволяет хозяину вклад быть допрошен, в то время как выбор различных опухолевых клеток линий позволяет вклад опухоли ангиогенез также будет рассмотрен5,6,7. Кроме того, как личинки зебры проницаемы для малых молекул, конкретные ингибиторы пути могут быть использованы или библиотеки наркотиков могут быть проверены для выявления новых ингибиторов опухолевого ангиогенеза8,9,10, 11.
Модель ксенотранспланта эмбриона зебры представляет уникальные преимущества по сравнению с другими моделями ксенотранспланта млекопитающих. Зебрафиш ксенотранспланты дешевле и проще в исполнении, большое количество животных могут быть рассмотрены и живой клеток изображения позволяет детальное изучение поведения клеток4. В отличие от других моделей in vivo, для наблюдения которых требуется до нескольких недель, ангиогенез у ксенотрансплантатов зебры можно наблюдать в пределах 24 ч после имплантации3,4. Однако, отсутствие адаптивной иммунной системы у эмбриональных зебры, в то время как полезно для поддержания ксенотрансплантата, означает, что адаптивный иммунный ответ и его вклад в ангиогенез опухоли не могут быть рассмотрены. Кроме того, отсутствие опухолевых стромальных клеток, неспособность к ортотопически имплантации опухоли и разница в температуре обслуживания между зебрафиши и клетки млекопитающих являются потенциальными недостатками этого метода. Тем не менее, удобство этой модели для живой визуализации и способность точно количественно ангиогенный ответ делает его однозначно полезным для изучения клеточных процессов, которые регулируют ангиогенез опухоли in vivo.
Первым важным шагом в протоколе является имплантация опухолевых клеток. Очень важно, чтобы клетки вводились в место, которое позволит ксенотрансплантатуспешно успешно имплантировать в эмбрион, не делая эмбрион отек. Инъекция, которая является слишком передней может позволить клеткам…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим г-на Алхада Махагаонкара за управление учреждением по производству зебры ВОклендского университета и Исследовательским отделом биомедицинских изображений, Школой медицинских наук, Оклендским университетом, за помощь в замедленной конфокальной микроскопии. Эта работа была поддержана Советом по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии грант (14/105), Королевское общество Новой Зеландии Марсден фонд проекта Грант (UOA1602) и Окленд медицинских исследований Фонд проекта Грант (1116012) присуждается JWA.
Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |