בVivo הדמיה וככמת של התגובה המארחת אנגיוגנטית ב-Zebrafish גידול Xenografts
Summary
מטרת שיטה זו היא ליצור מודל vivo של אנגיוגנזה הגידול על ידי תאי גידול של השתלת מיונקים לתוך העובר הזרע כי יש מתויג כלים של כלי דם. על ידי הדמיה של השתל מבע כלים משויכים, מדידה כמותית של תגובת האנגיוגנטית ניתן להשיג.
Abstract
אנגיוגנזה הגידול הוא יעד מפתח של טיפול נגד סרטן ושיטה זו פותחה כדי לספק מודל חדש כדי ללמוד את התהליך הזה vivo. דג זברה מבע נוצר על ידי שתילת תאים סרטניים מהיונקים לתוך החלל perivitelline של יומיים-לאחר הפריה דג זברה עוברים, ואחריו על ידי מדידת היקף התגובה אנגיוגנטית נצפתה בנקודת הקצה ניסיוני עד יומיים אחרי ההשתלה. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא היכולת לכמת במדויק את התגובה אנגיוגנטית מארח של דג את השתל. הדבר מאפשר בדיקה מפורטת של המנגנונים המולקולריים, כמו גם את התרומה המארחת לעומת הגידול לתגובה האנגיוגנטית. העוברים יכולים להיות חשופים למגוון טיפולים, כגון דגירה עם תרופות אנטי-אנגיוגנזה פוטנציאליות, כדי לחקור אסטרטגיות למניעת אנגיוגנזה של הגידול. תגובת האנגיוגנטית יכולה להיות גם בעלת התמונה החיה כדי לבחון תהליכים סלולאריים יותר דינמיים. הטכניקה הניסיונית יחסית בלתי תובענית, עלויות תחזוקה זולות של דג דג זברה וזמן ניסיוני קצר להפוך את המודל הזה שימושי במיוחד לפיתוח אסטרטגיות לתמרן אנגיוגנזה הגידול.
Introduction
אנגיוגנזה הוא אחד הסימנים הקלאסיים של סרטן ומייצג יעד של טיפול נגד סרטן1,2. כדי ללמוד את התהליך הזה, xהשתלת מודלים של סרטן נוצרו על ידי השתלת תאים סרטניים היונקים לתוך בעלי חיים כגון עכברים3. מודל דג זברה מבע יש גם פיתח, אשר כרוך ההשתלה של תאים סרטניים לתוך 2 ימים הפריה לאחר (dpi) דג זברה אשר התוצאה צמיחה מהירה של כלי דם דג זברה לתוך השתל מבע.
פרוטוקול זה מתאר vivo דג זברה העובר גידול מודל מבע שבו התגובה אנגיוגנטית ניתן לכמת במדויק על פני השתל כולו מבע שיטה זו מאפשרת לחוקר לבחון, בvivo, את המנגנונים המולקולריים הממפינים את תגובת הגידול האנטי-אנגיוגנטית. היכולת הגנטית של דג דג זברה מאפשר את התרומה המארחת להיחקר, בעוד הבחירה של קווי הגידול השונים תאים מאפשר את תרומת הגידול לאנגיוגנזה גם להיבדק5,6,7. בנוסף, כמו הזחלים דג זברה חדירות מולקולות קטנות, מעכבי מסלול ספציפי ניתן להשתמש או ספריות התרופות ניתן להקרנה כדי לזהות מעכבי הרומן של אנגיוגנזה הגידול8,9,10, . בסדר, 11
מודל העובר של הדג מציג יתרונות ייחודיים בהשוואה למודלים אחרים של היונקים האחרים. Zebrafish xשתלים הם זולים יותר לבצע, מספר גדול של בעלי חיים ניתן לבחון לחיות הדמיה תא מאפשר בדיקה מפורטת של התנהגות התא4. שלא כמו אחרים vivo מודלים, אשר דורשים עד כמה שבועות כדי להתבונן צמיחה כלי משמעותי, אנגיוגנזה ב-דג זברה xenografts ניתן לראות בתוך 24 h בעקבות השרשה3,4. עם זאת, העדר מערכת חיסונית אדפטיבית מתחלקים, בעוד מועיל לשמור על השתל xenograft פירושו התגובה החיסונית אדפטיבית ותרומתו כלפי אנגיוגנזה הגידול לא ניתן לבחון. בנוסף, העדר של תאים סטרומה הגידול, חוסר היכולת להשתיל למריחה על הגידול ואת ההבדל בטמפרטורת התחזוקה בין התאים המרכיניים ותאי היונקים הם חולשות פוטנציאליות של שיטה זו. למרות זאת, היכולת המועלת של מודל זה להדמיה חיה והיכולת לכמת באופן מדויק את תגובת האנגיוגנטית הופכת אותו למועיל בצורה ייחודית ללימוד התהליכים הסלולאריים המייוסתים את האנגיוגנזה של הגידול בvivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
הצעד הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא השרשה של תאי הגידול. חיוני כי התאים מוזרק לתוך מיקום שיאפשר מבע להשתיל בהצלחה העובר מבלי להפוך את העובר מתרפס. זריקה הקדמי מדי יכול לאפשר לתאים לנוע לעבר הלב, חסימת הדם והמוביל בצקת, בעוד הזרקה כי הוא האחורי יותר מדי יגרום מושתל לקוי xenograft. הזרקה קדמית היא הט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר אליש מאהגאונקאר לניהול מתקן הבית של אוניברסיטת אוקלנד והיחידה לחקר הדמיה ביו-רפואית, ביה ס למדעי הרפואה, אוניברסיטת אוקלנד, לסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת מחקר הבריאות של ניו זילנד מענק הפרויקט (14/105), החברה המלכותית של ניו זילנד מרסדן קרן מUOA1602 פרויקט מענק () ו אוקלנד מחקר רפואי קרן פרויקט גרנט (1116012) הוענק J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Cancer Research. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Research. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Cancer Research. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Cancer Research. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
