Burada, fare deri içine geçirgenliği teşvik ajanların intradermal yönetimi tarafından indüklenen vasküler sızıntı ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik yeteneği teşvik veya vasküler sızıntı engelleyen veya vasküler geçirgenliği düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için moleküllerin belirlemek için kullanılabilir.
Omurgalı organizmalarda vasküler endotel birincil işlevi kan ve mademki endotel kan hücreleri, plazma oluştururlar ve Su geçirgenliği göre adapte edilebilir vücudun her doku arasında bir engel olarak hizmet etmektir fizyolojik gerek. Bazı hastalıklar, sitokinler ve büyüme faktörleri geçici damar geçirgenliği artırmak için endotel bariyer hedefleyen serbest bırakılır; Ancak, uzun süre varlıklarını kronik vasküler hyperpermeability ve ödem böylece doku zarar neden olabilir. Mil tahlil araştırmacılar damar hyperpermeability damar sızıntı proxy ölçümü ile çalışmaya olanak sağlayan bir vivo içinde tekniğidir. Burada, memeli fizyolojisi ve patoloji çalışmaya en yaygın olarak kullanılan model organizmadır fareyi, bu yordamı gerçekleştirme hakkında ayrıntılı bir protokol sağlar. Yordamı Evans mavi boya geçirgenliği indükleyici ajanlar ve araç kontrol çözümleri birden çok intradermal enjeksiyon tarafından içine karşıt yanları fare takip dolaşımdaki albümin etiketlemek için İntravenöz enjeksiyon içerir. Sonuç olarak, Evans mavi boya yavaş yavaş nerede birikir ve miktar olarak kaçak araç göre geçirgenliği indükleyici aracı tarafından indüklenen için çıkarılan dermise sızdırıyor. Mil tahlil vahşi yazıyla gerçekleştirilen yeniden ya da genetik olarak fare modelleri değişiklik ve aracıları/hedefleri inducing veya engelleme yeteneğine sahip tanımlamak ve vasküler geçirgenliği düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için ilaç idaresi ile kombine edilebilir hyperpermeability.
Kardiyovasküler sistem birincil dolaşım ve dokularda tüm organları arasında gaz, besin ve atık ürünlerin transferini sağlamak amacıyla işlevidir. Kan damarlarının bazal geçirgenliği böyle değişimleri1izin vermek için organ özgü seviyeleri var. Örneğin, sıkı, son derece delinmez arabirimi2,3,4kan beyin bariyerini oluşturur iken kan damarları böbrek aşırı geçirgen. Kan damarlarının iç astar formu endotel hücreleri dolaşım ve temel alınan dokular arasında fiziksel bir engeli sağlamak ve vasküler geçirgenliği bir organ özgü şekilde düzenler. Ancak, belirli uyaranlara endotel bariyer üstündeki bazal düzeyleri1interstitium dolaşıma gelen sıvı ekstravazasyonu artırmak için kısmi bir arıza neden. Doku iskemi bir kontur veya miyokard infarktüsü, nedeniyle sırasıyla ortaya çıktığında böyle hyperpermeability, örneğin, doku travması, iltihap, tümör, siteleri, sepsis, neovasküler hastalığı olan veya beyin ve kalp, gözler sırasında görülmektedir 5 , 6 , 7 , 8. ne zaman kronik olarak yüksek, hyperpermeability ödem, sırayla göz hastalığı9görme kaybı gibi doku hasarına neden olan yol açar. Böylece, vasküler hyperpermeability yanıt modelleme endotel geçirgenlik artışı mekanizmaları anlamak için ve bu etkisizleştirmek için tasarlanmış ajanların etkinliğini test etmek için arzu edilir.
Mil tahlil vasküler sızıntı vivo içinde vasküler hyperpermeability vekil ölçüsü ölçer köklü, yaygın olarak kullanılan ve nispeten basit bir tekniktir. Bağımsız olarak endotel bariyer yönetmelik, kan basıncı veya kan akımı, gibi vasküler sızıntı artıran faktörler bileşik dikkate almaz olsa bile mil tahlil değerlendirmek için güvenilir bir yöntem sağlamak için genel olarak düşünülmektedir geçirgenliği oransal etkinlik maddelerin ve faaliyetlerini teşvik sinyal arabulucu tanımlamak. Buna göre mil tahlil vasküler hyperpermeability arabulucu ve mekanizmaları eylem10,11,12,13, belirledik çok sayıda çalışma ayrılmaz oldu 14,15, gibi vasküler endotelyal büyüme faktörü VEGF-A Bu aslında vasküler geçirgenliği faktör VPF16olarak belirlendi.
Aslında mil ve mil eskiden şiling şimdi pigs17vasküler geçirgenliği çalışmaya tarafından geliştirilen, onların tahlil daha sonra vasküler geçirgenliği moleküler mekanizmaları aydınlatmak için seçtiğiniz model organizma şimdi olan fare kullanarak için uyarlanmıştır Yönetmelik genetik manipülasyon için mükemmel uygunluk nedeniyle. Kısaca, Evans mavi boya intravenöz yetişkin fareler enjekte ve 30 dakikadır (Şekil 1) dolaşmaya izin. Araç kontrol karşı geçirgenliği indükleyici ajanlar sonra intradermally karşıt yanları vasküler sızıntı (Şekil 1) teşvik için fare üzerinde birçok sitede enjekte edilir. Sonuç olarak, albümin bağlı Evans mavi boya extravasates ve dermiste (Şekil 1) birikir. İnsanca fare yüzey kaldırma sonra Evans mavi dermis çıkarılan ve vasküler sızıntı düzeyini test madde ve araç indüklenen bir oranı olarak optik yoğunluk (Şekil 2) hesaplanır.
195217ilk açıklamasını beri mil tahlil araştırmacılar ile vasküler hyperpermeability moleküler mekanizmaları eğitim için nispeten hızlı, basit ve güvenilir bir yöntem sağlamıştır. Örneğin, mil tahlil yeteneği ve/veya farklı ajanlar potens hyperpermeability19,20,21 ikna etmek için veya hyperpermeability engelleme ajanlar8 etkinliğini test etmek için test etmek için kullanılan ,22,23. Başka bir örnek olarak, vasküler geçirgenliği neden ajanları genetik fareler ve onların littermate denetimleri belirli reseptörleri ve sinyal proteinleri ligand kaynaklı hyperpermeability transducing gereksinimlerini belirlemek için test edilmiştir Yanıt-e doğru10,11,12,13,14,15,20,23. Değiştirilmiş sürümlerini birkaç mil tahlil beri örneğin kullanılan izleme ile ilgili olarak kullanılmaktadır. Böylece, Evans mavi floresans etiketli dextrans farklı boyutlarda veya mikroküreler11,13ile bazı çalışmalarda değiştirdi.
Vasküler hyperpermeability mekanizmaları araştıran için diğer deneyleri ana avantajı mil testin bu gerçekleştirmek nispeten kolay ve pahalı ekipman gerektirmez olmasıdır. Akı deneyleri veya trans endotel elektrik direnci (Trans iyi gibi olarak sızıntı ile ölçme için karşı vitro Ayrıca, bu tahlil modelleri vasküler sızıntı olduğu gibi kan damarlarının bağlamda bir vivo içinde Teknik olarak deneyi Sadece, endotel monolayer üzerinde odaklanmak aylarının) deneyleri. Vasküler hyperpermeability alternatif vivo deneyleri farklı teslim yolu hyperpermeability-inducing Aracısı kullanan veya farklı sitelerdeki vasküler sızıntı için analiz burada açıklanan mil tahlil farklı olabilir bir ajan vasküler sızıntı sınavı-akciğerler ve nefes borusu11,13,15ardından kuyruk ven yoluyla sistemik teslim tarafından örneği. Belirli intradermal enjeksiyon ilke olarak, kan basıncı ve akışı yanı sıra endotel bariyer bozulma da etkiler ve bu nedenle, vasküler geçirgenliği de dolaylı etkisi olduğunu, mil testin bir kısıtlamadır. Yine de, bu tahlil son zamanlarda vasküler geçirgenliği tarafından indüklenen ölçmek için gösterilmiştir VEGF-A bağımsız olarak sistemik kan basıncı15üzerindeki etkileri. Başka bir mil testin farklı dokularda damar yataklar için farklı ajanlar geçirgenliği teşvik ve deride bir mil tahlil ile elde edilen sonuçlar bu nedenle, olabilir temsilcisi, örneğin, ne oluşur yanıt verebilir kısıtlamadır akciğer veya beyin.
Hayvanın yaşı ve kilosu mil assay olarak gözlenen sızıntı etkileyebilir. Bu değişkenler etkisini en aza indirmek için araştırmacılar littermates kullanmalısınız veya benzer şekilde boy ve fare denetimleri olarak yaşlı. Fare mutantlar için belirli bir gen ilgi değerlendirirken, fareler Heterozigoz Heterozigoz üreme stratejisi ve wildtype kaldırmak littermates denetimleri kullanılan karşı aracılığıyla oluşturulan. Ayrıca, hızlı bir şekilde ters çevrilebilir gaz anestezikler, isoflurane gibi parenteral enjeksiyonları24,25yönetilen bir anestezik ilaç için açıklanan vazokonstriksiyona önlemek için kullanılması önerilir. Evans mavi boya fare yan kuyruk ven içine enjeksiyon bu protokolü kritik bir adımdır ve deney ve veri kalitesini büyük ölçüde etkileyebilir. Bu nedenle, araştırmacılar kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmek için yetkili olması gerekir ve olacak büyük olasılıkla var deneme önce deneyimi veya uygulama mil tahlil başlamadan. Alternatif olarak, araştırmacılar intravenöz diğer yolları Evans mavi ile deneyimli olmaları durumunda retro-orbital enjeksiyon gibi sunmak için kullanabilirsiniz. Geçirgenliği teşvik intradermal enjeksiyon çözümleri cilt Ajan bağımsız zarar neden olabilir. Bu nedenle, intradermal enjeksiyon hacmi 20 µl geçmemelidir, her zaman olmalı histamin inhibitörü huzurunda yapılan ve araç kontrol enjeksiyonu için normalleştirilmiş.
Vasküler geçirgenliği VEGF A bağlı kanser hastaları16 ve vizyon kararlar almanı ödemi birkaç neovasküler asit nedeniyle mil tahlil pek çok araştırmacı tarafından VEGF-bir sinyal yolu, örneğin, bileşenleri değerlendirmek için kullanılmıştır göz hastalığı7. Bu nedenle, biz ve diğerleri mil tahlil VEGF-A indüklenen vasküler sızıntı VEGF-bir sinyal art arda sıralı12,13,14, , belirli bileşenlerini eksikliği için genetik olarak değiştirilmiş farelerde karşılaştırmak için kullanılan 15 , 20 , 23. bu yaklaşımı kullanarak bizim yeni çalışma ana patolojik VEGF-A izoformu, VEGF165, VEGFR2 ve NRP1, NRP1 sitoplazmik etki alanı SRC aile kinaz ABL kinaz-aracılı aktivasyonu teşvik bir kompleks sinyalleri ortaya bir hyperpermeability yanıt14uyandırmak için. VEGFA de kan damarı büyümesini destekler ve bu nedenle, tedavi amaçlı hyperpermeability faaliyetlerini özel olarak inhibe iskemik dokulara kan akışını geri için kullanılan olabilir. Araştırma VEGF-A yanıt karşı damar hyperpermeability damar endotel hücreleri, ederek, moleküler mekanizması elucidating bu nedenle, seçmeli olarak patolojik VEGF-A bağlı ödem etkisizleştirmek için manipüle edilebilir yollar tanımlayabilir hastalıklar, kanser veya iskemik göz hastalığı gibi. Mil tahlil şüphesiz bunlar ve diğer birçok türde moleküler düzenleyiciler ve vasküler hyperpermeability effectors aydınlatmak için fonksiyonel çalışmaları desteklemek için yararlı bir yöntem olmaya devam edecektir.
The authors have nothing to disclose.
Laura Denti teşekkür ediyoruz, fare yetiştiriciliği ve Camille Charoy ile Valentina Senatore ve personel için Oftalmoloji UCL Enstitüsü biyolojik kaynakları birimi teknik destek için yardım et. Bu eser C. Ruhrberg ve bir İngiliz kalp Vakfı doktora öğrencilik J.T. küstah (FS/13/59/30649) için bir tıbbi araştırma Konseyi grant (Bay/N011511/1) tarafından desteklenmiştir.
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |