Nous présentons ici un protocole visant à mesurer la perméabilité vasculaire induite par l’administration intradermique des agents favorisant la perméabilité dans la peau de souris. Cette technique peut servir à déterminer la capacité des molécules à promouvoir ou à inhiber une fuite vasculaire ou d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la perméabilité vasculaire.
La fonction première de l’endothélium vasculaire chez les organismes vertébrés est de servir comme une barrière entre le sang et chaque tissu du corps, auquel cas la perméabilité de l’endothélium de globules, macromolécules de plasma et d’eau peut être adaptée selon le besoin physiologique. Dans certaines maladies, cytokines et facteurs de croissance sont libérés qui ciblent la barrière endothéliale pour augmenter temporairement la perméabilité vasculaire ; Toutefois, leur présence prolongée peut provoquer une hyperperméabilité vasculaire chronique et œdème ainsi nocifs pour les tissus. L’essai de Miles est une technique in vivo qui permet aux chercheurs d’étudier l’hyperperméabilité vasculaire grâce à la mesure de la procuration de perméabilité vasculaire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé sur la façon d’effectuer cette procédure chez la souris, qui est l’organisme modèle le plus couramment utilisé pour étudier les mammifères physiologie et pathologie. La procédure consiste en l’injection intraveineuse de bleu Evans d’étiqueter l’albumine circulante, suivie de multiples injections intradermiques de perméabilité-inducteurs enzymatiques et solutions de contrôle de véhicule en s’opposant à flancs de la souris. En conséquence, bleu Evans s’infiltre progressivement dans le derme, où il s’accumule et peut être extrait pour la quantification en fuite induite par l’agent induisant la perméabilité par rapport au véhicule. Le dosage de Miles peut être effectué chez le type sauvage ou génétiquement modifié des souris modèles et peut être combiné avec la FDA afin d’étudier les mécanismes moléculaires qui régissent la perméabilité vasculaire et identifient des agents/cibles capables d’induire ou de blocage hyperperméabilité.
La fonction première du système cardio-vasculaire est de permettre le transfert des gaz, des nutriments et des déchets produits entre la circulation et les tissus dans tous les organes. Les vaisseaux sanguins ont des niveaux de certains organes de perméabilité basale pour permettre ces échanges1. Par exemple, les vaisseaux sanguins dans les reins sont très perméables, alors que la barrière hémato encéphalique constitue une interface hautement impénétrable serré2,3,4. Les cellules endothéliales qui forment la paroi interne des vaisseaux sanguins constituent une barrière physique entre la circulation et les tissus sous-jacents et réglementent la perméabilité vasculaire de manière spécifiques d’organes. Toutefois, certains stimuli provoque une rupture partielle de la barrière endothéliale pour augmenter l’extravasation fluide de la circulation dans l’interstitium au-dessus du taux de base1. Cette hyperperméabilité est observée, par exemple, sur les sites de traumatisme tissulaire, une inflammation, des tumeurs, au cours de septicémie, yeux atteints de DMLA néovasculaire maladie ou dans le cerveau et le coeur, l’ischémie tissulaire se produit en raison d’un accident vasculaire cérébral ou un infarctus du myocarde, respectivement 5 , 6 , 7 , 8. Lorsque chroniquement élevé, hyperperméabilité conduit à un oedème, qui provoque des lésions tissulaires, tels que la perte de la vision à le œil la maladie9. Modélisation de la réponse de l’hyperperméabilité vasculaire est donc souhaitable pour comprendre les mécanismes qui augmentent la perméabilité endothéliale et de tester l’efficacité des agents conçus pour empêcher cela.
L’essai de Miles est une technique relativement simple, bien établie et couramment utilisée qui mesure une fuite vasculaire en vivo comme une mesure de substitution de l’hyperperméabilité vasculaire. Même s’il ne prend pas en compte les facteurs qui peuvent augmenter la perméabilité vasculaire indépendamment de règlement de la barrière endothéliale, tels que la pression sanguine ou la circulation sanguine, de mélange, le dosage de Miles est généralement considéré pour fournir une méthode fiable pour évaluer le perméabilité-modulation de l’activité des substances et identifier les signalisation des médiateurs qui favorisent leur activité. Par conséquent, le test de Miles a été partie intégrante de nombreuses études qui ont identifié des médiateurs de l’hyperperméabilité vasculaire et leurs mécanismes d’action10,11,12,13, 14,15, tel que le facteur de croissance endothélial vasculaire VEGF-A, qui a été initialement identifiée comme étant le facteur de perméabilité vasculaire VPF16.
Initialement développé par Miles et des Miles pour étudier la perméabilité vasculaire en cobayes17, leur dosage a été par la suite adapté à l’utilisation de souris, qui sont maintenant l’organisme modèle de choix pour élucider les mécanismes moléculaires de la perméabilité vasculaire règlement en raison de leurs qualités exquises de manipulation génétique. En bref, bleu Evans est par voie intraveineuse injectées à des souris adultes et autorisés à circuler pendant 30 minutes (Figure 1). Perméabilité-inducteurs enzymatiques, par opposition à contrôle de véhicule sont ensuite par voie intradermique injectées dans des sites multiples sur l’opposition des flancs de la souris pour induire la fuite vasculaire (Figure 1). Par conséquent, lié à l’albumine bleu Evans extravasates et s’accumule dans le derme (Figure 1). Après la souris d’abattage sans cruauté, bleu Evans est extraite à partir du derme et le niveau de fuite vasculaire calculé comme un rapport de test substance pour véhicule-induite par la densité optique (Figure 2).
Depuis sa première description en 1952,17, le dosage de Miles a fourni des chercheurs avec une méthode relativement rapide, simple et fiable pour étudier les mécanismes moléculaires de l’hyperperméabilité vasculaire. Par exemple, le dosage de Miles a été utilisé pour tester la capacité et/ou la puissance de différents agents pour induire l’hyperperméabilité19,20,21 ou pour tester l’efficacité de l’hyperperméabilité blocage agents8 ,22,23. Comme autre exemple, les agents qui induisent la perméabilité vasculaire ont été testés chez des souris génétiquement modifiées et leurs contrôles de même portée pour déterminer les exigences des récepteurs spécifiques et signal transduction de protéines pour l’hyperperméabilité induite par le ligand réponses10,11,12,13,14,15,20,23. Plusieurs versions modifiées du dosage Miles ont depuis été utilisées, par exemple en ce qui concerne le traceur utilisé. Ainsi, le bleu Evans a été substitué dans certaines études avec fluorescence-étiquetée dextrans de différentes tailles ou microsphères11,13.
Le principal avantage de l’essai de Miles sur autres épreuves pour enquêter sur les mécanismes de l’hyperperméabilité vasculaire est qu’il est relativement facile à réaliser et ne nécessite pas de matériel coûteux. En outre, comme une technique in vivo , ce dosage modèles une fuite vasculaire dans le contexte des vaisseaux sanguins intacts, par opposition à la mesure des fuites par in vitro tests tels que trans bien des essais de flux ou trans endothélial résistance électrique ( Essais de TEER), qui, seul, l’accent sur la monocouche endothéliale. Les dosages alternatives in vivo d’hyperperméabilité vasculaire peuvent différer de l’essai de Miles décrite ici en utilisant un itinéraire de livraison différente de l’agent inducteur hyperperméabilité ou en analysant une fuite vasculaire à différents endroits, pour exemple de délivrance systémique d’un agent via la veine caudale, suivie d’une fuite vasculaire examen dans les poumons ou la trachée11,13,15. Une des limites de l’essai de Miles sont que l’injection intradermique de certains agents peut, en principe, influencent également la tension artérielle et le débit en plus de la rupture de la barrière endothéliale et, par conséquent, influer sur la perméabilité vasculaire aussi indirectement. Néanmoins, ce dosage a été récemment montré pour mesurer la perméabilité vasculaire induite par le VEGF-A indépendamment des effets sur la pression artérielle systémique15. Une autre limite de l’essai de Miles, c’est que les lits vasculaires dans différents tissus peuvent répondre différemment aux agents favorisant la perméabilité et les résultats obtenus avec un dosage de Miles dans la peau, donc peut-être pas représentant, par exemple, de ce qui se passe dans le poumons ou du cerveau.
Âge et le poids de l’animal peuvent influencer la fuite observée dans l’essai de Miles. Pour minimiser l’effet de ces variables, les chercheurs devraient utiliser la même portée ou de même taille et âgés de souris sous forme de contrôles. Lors de l’évaluation des souris mutantes pour un gène d’intérêt, souris doivent être générés par un hétérozygote par rapport aux reproducteurs hétérozygotes stratégie et type sauvage de même portée utilisée comme témoins. Par ailleurs, il est conseillé d’utiliser les anesthésiques gaz rapidement réversible, comme l’isoflurane, afin d’éviter une vasoconstriction, ce qui a été décrit pour certains médicaments anesthésiques administrés par injections parentérales24,25. L’injection de bleu Evans dans la veine latérale queue de souris est une étape essentielle dans le présent protocole et peut grandement influencer la qualité de l’expérience et les données. Ainsi, les chercheurs doivent être compétentes dans l’exercice de queue veine injections et fera probablement besoin d’une expérience antérieure ou la pratique avant de débuter que les milles d’analyse des expériences. Sinon, chercheurs peuvent utiliser autres voies intraveineuse pour livrer Evans blue, telles que l’injection rétro-orbitaire s’ils sont expérimentés avec elle. Injection intradermique de favorisant la perméabilité solutions peuvent endommager agent indépendant à la peau. Par conséquent, injections intradermiques ne doit pas dépasser 20 µl volume, devraient toujours être effectuées en présence de l’inhibiteur de l’histamine et normalisées à injections de contrôle de véhicule.
Le dosage de Miles a été utilisé par de nombreux chercheurs d’évaluer les composantes de la voie signalisation de VEGF-A, par exemple, parce que la perméabilité vasculaire induite par VEGF-A cause d’ascite chez cancer patients16 et nuire à la vision de le œdème dans plusieurs néovasculaire sur la maladie de le œil7. Ainsi, nous et autres avons utilisé le test de Miles pour comparer le VEGF-A provoqué une fuite vasculaire chez les souris qui ont été génétiquement modifiés pour manque de composants spécifiques du VEGF-A signalisation cascade12,13,14, 15 , 20 , 23. notre étude récente utilisant cette approche, a révélé que l’isoforme VEGF-A pathologique principal VEGF165, signaux grâce à un complexe de VEGFR2 et NRP1, dans lequel le domaine cytoplasmique NRP1 favorise l’activation induite par la kinase ABL des kinases de la famille SRC pour évoquer une hyperperméabilité réponse14. VEGFA aussi favorise la croissance des vaisseaux sanguins et pourrait, par conséquent, être utilisé thérapeutiquement pour restaurer le flux sanguin vers les tissus ischémiques si ses activités hyperperméabilité pouvaient être inhibées spécifiquement. Recherche élucider le mécanisme moléculaire qui oriente le VEGF-A les réponses des cellules endothéliales vasculaires vers hyperperméabilité vasculaire pourrait, par conséquent identifier les voies qui peuvent être manipulées de manière sélective pour inhiber pathologique oedème de VEGF-A induit dans les maladies, comme le cancer ou les maladies ischémiques oculaires. Le dosage de Miles continuera sans doute à être une méthode utile pour étayer ces et beaucoup d’autres types d’études fonctionnelles d’élucider moléculaires responsables de la réglementation et les effecteurs de l’hyperperméabilité vasculaire.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Laura Denti, Valentina Senatore et le personnel de l’unité de ressources biologiques à l’Institut d’ophtalmologie de l’UCL pour aide avec l’élevage de souris et Camille Charoy pour le support technique. Ce travail a été soutenu par une subvention du Conseil de recherches médicales (MR/N011511/1) C. Ruhrberg et une bourse d’étude British Heart Foundation PhD à J.T. Brash (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |