ここでは、マウスの皮膚に透過性促進剤の皮内投与により血管漏出を測定するためのプロトコルを提案する.この手法は、促進、あるいは血管漏れを抑制または血管の透過性を調節する分子機構を研究する分子の能力を決定する使用できます。
脊椎動物の生物における血管内皮細胞の主な機能は、血液と血液細胞、プラズマ高分子と水に内皮細胞の透過性によると合わせることができるという、体の各組織間の障壁として機能するには生理学的な必要はありません。特定疾患におけるサイトカインおよび成長因子が解放される一過性の血管透過性を増加する内皮障壁を対象とします。ただし、彼らの長期の存在は、慢性血管血管と浮腫のことにより組織損傷を引き起こす可能性があります。マイル アッセイは、血管漏れのプロキシの測定を通して血管血管を研究する研究者を可能にする生体内で手法です。ここでは、哺乳類の生理学と病理学を研究に最も広く使用されているモデル生物であるマウスでこの手順を実行する方法の詳細なプロトコルを提供します。プロシージャは、ラベルをマウスの側面に反対に透過性誘導剤と車両制御ソリューションの複数の皮内注射が続く循環アルブミンにエバンス ブルー色素の静脈内投与を含みます。その結果、エバンス ブルー色素は、徐々 にそれが蓄積し、車両に対する透過性誘導剤による漏れと定量化のため抽出することができます真皮にリークします。マイル アッセイ野生型で実行することができますまたは遺伝的マウスモデルを変更し、血管の透過性を調節し、エージェント/ターゲットの誘導またはブロックできるを識別する分子機構を研究対象に薬剤管理と組み合わせることがしたがって。
心血管システムの主な機能は循環のすべての臓器組織間ガス, 栄養素, と廃棄物の転送を有効にするのには。血管は、このような交換の1を許可するように基底の透磁率の臓器固有のレベルを持っています。例えば、腎臓の血管が血液脳関門を形成するタイトな非常に不可解なインタ フェース2,3,4ながら、浸透性の高い。血管の内側の粘膜を形成する内皮細胞は循環と基になる組織の間の物理的な障壁を提供して臓器特異的に血管透過性を調節します。しかし、ある特定の刺激は基底のレベル1を超える間に循環からの流体の漏出を高めるため内皮障壁の部分的崩壊を引き起こします。このような血管は、たとえば、サイトで観測された組織の外傷、炎症、腫瘍での敗血症、新生血管の疾患、脳や心臓、目の中に組織の虚血が発生するとそれぞれ脳卒中や心筋梗塞が原因5,6,7,8します。 慢性的に上昇、血管浮腫、眼疾患9に視力の低下など、組織の損傷が原因となりが発生。したがって、血管血管応答のモデリングは血管透過性を増加するメカニズムを理解するため、これを阻害するエージェントの有効性をテストすることが望ましい。
マイル アッセイは、血管の血管の代理指標として体内の血管漏れ対策確立、一般的に使用される、比較的単純な手法です。マイル アッセイが評価する信頼性の高い方法を提供する考えが一般に血圧や血流などの内皮障壁規制とは関係なく血管漏れを高める可能性があります因子を配合アカウントに入れないのに、物質の透磁率変調活動し、彼らの活動を促進するシグナル伝達の仲介。したがって、マイル アッセイは血管の血管のメディエーターとアクション10、11,12,13,のメカニズムを識別した数多くの研究に不可欠なされている14,15など血管内皮増殖因子 VEGF のことはもともと VPF16血管透過性因子として同定されました。
もともとモルモット17血管透過性亢進を勉強するマイルとマイルによって開発された, その分析後に適応されました選択血管透過性の分子機構を解明するためのモデル生物であるマウスを使用して遺伝子操作に彼らの絶妙な適合性のための規則。簡単に言えば、エバンス ブルー色素を静脈内に成体マウスに注入し、30 分 (図 1) を循環させること。車両制御対透水性誘導剤は血管漏出 (図 1) を誘発するために、マウスの側面に反対で複数のサイトでは皮内注射します。その結果、アルブミン結合エバンス ブルー色素は extravasates、(図 1) 真皮に蓄積されます。後マウスをカリング人道的、エバンス ブルーは真皮から抽出され血管漏出のレベルは光学濃度 (図 2) 物質-車両によるテストの比率として計算されます。
195217の最初の記述からマイル アッセイは血管の血管の分子機構を研究するため比較的、簡単、迅速かつ信頼性の高い方法で研究者を提供しています。たとえば、マイル アッセイは、したがって19,20,21を誘発するまたは血管ブロック エージェント8 の有効性をテストする能力や異なるエージェントの効力をテストする使用されています、22,23。別の例として血管透過性亢進を誘発するエージェントは、遺伝子改変マウス及び特定の受容体とシグナル伝達タンパク質リガンド誘導性の血管のための要件を決定する彼らの濾胞でテストされています。レスポンス10、11,12,13,14,15,20,23。マイルの試金のいくつかの変更されたバージョンはので、トレーサーの使用に関して、例えば使用されています。したがって、さまざまなサイズの微粒子11,13dextrans の蛍光標識といくつかの研究でエバンス ブルーを置き換えられます。
血管血管メカニズムを調査するため他のアッセイのマイル アッセイの主な利点はそれが比較的容易に行えるし、高価な機器を必要としません。さらに、そのまま血管のコンテキストでこのアッセイのモデルの血管漏れ、体内法を通して漏れを測定に関係なく体外試金のトランスもフラックス アッセイまたはトランス内皮電気抵抗 (のようTEER) アッセイは、内皮細胞の単層のみ、焦点します。したがって誘導剤の異なる配送ルートを活用してまたはのため別のサイトで血管漏れを分析することによって、ここで説明するマイル アッセイから血管血管の代替生体内で試金が異なる場合があります。続いて血管漏れ検査、肺や気管の11,13,15尾静脈を介してエージェントの全身投与による例です。マイルの試金の制限の 1 つは、します特定のエージェントの皮内注射、原則としても血圧と内皮バリアに加えてフローに影響も直接血管の透過性の影響をそのため。それにもかかわらず、この試金は最近による血管透過性を測定するため示されている VEGF の全身血圧15に及ぼす影響とは無関係。マイルの試金のもう一つの制限は、さまざまな組織で血管ベッドに異なる透過性促進剤及び皮膚のマイルの試験で得られた結果できない場合があります、したがって、代表などで発生する内容の応答可能性があります、肺や脳。
動物の年齢と体重は、マイルのアッセイで漏に影響を与える可能性があります。研究者をこれらの変数の影響を最小限に抑えるには、同腹子を使用する必要がありますまたは同様にサイズを使用して、コントロールとしてマウスを高齢者します。ときマウス興味の特定遺伝子の変異を評価し、マウス コントロールとして使用されるヘテロ接合体の繁殖戦略と野生型同腹子対ヘテロ接合体を生成します。さらに、いくつかの麻酔薬を静脈注射24,25を介して投与の記載されている血管収縮を避けるためにすぐに元に戻せる状態のガス麻酔薬イソフルランなどを使用することをお勧めします。マウス外側尾静脈にエバンス ブルー色素の注入はこのプロトコルの重要なステップを実験とデータの品質に大きく影響することができます。したがって、研究者は尾静脈注射を行う主務する必要があります、可能性があります必要があります経験またはマイル測定開始前に練習実験します。代わりに、研究者は、エバンス ブルー、レトロな軌道注入それを経験している場合などを提供するのに他の静脈内のルートを使用できます。透過性促進の皮内注射ソリューションは皮膚にエージェントに依存しない損傷を引き起こすことができます。そのため、皮内注射ボリュームの 20 μ l を超えないようにする必要があります、する必要があります常にヒスタミン阻害剤の存在下で行わし、車両制御の注射に正規化します。
マイル アッセイに使用されている多くの研究者によって、VEGF のシグナル伝達経路のたとえば、コンポーネントを評価 VEGF A 誘発血管透過性亢進の原因腹水癌患者16とビジョンを損なういくつかの新生血管浮腫目の病気7。私たちと他の人が VEGF A シグナル伝達カスケード12,13,14,の特定のコンポーネントの不足のために遺伝的に変更されたマウスにおける VEGF の誘導血管漏れを比較するのにマイルの試金を使用しているため、15,20,23. メインの病理学的 VEGF のアイソ VEGF165、信号 VEGFR2 と NRP1 の細胞質ドメインが SRC 家族キナーゼの ABL キナーゼを介した活性化を促進する NRP1 の複合体を介して、このアプローチを使用して私たちの最近の研究が明らかに14血管の応答を呼び起こす。VEGFA はまた血管の成長を促進する、その血管の活動は具体的には抑制されること場合、虚血性の組織に血流を回復する治療に使用可能性があります、したがって。操縦する血管の血管に向かって血管内皮細胞の VEGF の応答分子機構の解明研究があります、したがって、病理学的 VEGF A 誘発浮腫を抑制する選択的に操作できる経路を識別がんや虚血性眼疾患等の疾患。マイルの試金はこれらと分子のレギュレータと血管血管のエフェクターを解明する機能研究の他の多くの種類を支えるための便利な方法をする間違いなくいきます。
The authors have nothing to disclose.
我々 は感謝ローラ Denti、ヴァレンティーナなガール フレンドとの UCL 眼科研究所で生物資源部スタッフは、テクニカル サポートのマウス飼育とカミーユ Charoy ヘルプします。この作品は、c. Ruhrberg、j. t. ブラッシュ (FS/13/59/30649) に英国心臓財団博士課程学生の身分 (氏/N011511/1) 医学研究評議会の助成金によって支えられました。
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |