Здесь мы представляем протокол для измерения сосудистые утечки, вызванных внутрикожные администрации проницаемости содействие агентов в мышиных кожу. Этот метод может использоваться для определения способности молекул содействовать или препятствовать сосудистые утечки или изучать молекулярные механизмы, которые регулируют проницаемость сосудов.
Основная функция эндотелия в позвоночных организмов является служить барьер между кровью и каждой ткани тела, whereby проницаемость эндотелия клетки крови, плазмы макромолекул и вода могут быть адаптированы согласно физиологические потребности. В некоторых заболеваний факторов роста и цитокинов выпускаются ориентированные эндотелиальный барьер временно увеличить проницаемость сосудов; Однако их длительное присутствие может привести к хронической сосудистой hyperpermeability и таким образом повреждение тканей отек. Assay км является техника в естественных условиях , которая позволяет исследователям изучить сосудистой hyperpermeability через прокси измерения сосудистые утечки. Здесь мы предоставляем подробный протокол о том, как выполнить эту процедуру в мышь, которая является наиболее широко используется модель организма для изучения млекопитающих физиологии и патологии. Процедура включает в себя внутривенным введением Эванс синий краситель для обозначения циркулирующего альбумина, последовали несколько внутрикожные инъекции проницаемости возбудителей и решения управления транспортного средства на противоположных склонах мыши. Следовательно Эванс синий краситель постепенно просачивается в дерме, где он накапливается и могут быть извлечены для количественной оценки как утечки, вызванных проницаемость заставить агент относительно транспортного средства. Миль может быть выполнена в дикого типа или генетически изменения мыши модели и могут быть объединены с лекарствами для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют проницаемость сосудов и определить агенты/цели способны заставить или блокирование hyperpermeability.
Основная функция сердечно-сосудистой системы является возможность передачи газов, питательных веществ и отходов между циркуляции и тканей во всех органах. Кровеносные сосуды имеют органоспецифическая уровень базальной проницаемости разрешить такие обмены1. К примеру кровеносные сосуды в почках высокой проницаемостью, в то время как гематоэнцефалический барьер образует плотный, высоко непроницаемый интерфейс2,3,4. Эндотелиальные клетки, которые формируют внутренней оболочки сосудов обеспечивают физический барьер между циркуляции и подлежащих тканей и регулировать сосудистой проницаемости органоспецифическая образом. Однако определенные стимулы вызывают частичное разбивка эндотелиальный барьер для увеличения жидкости кровоподтек из обращения в интерстиции выше Базальные уровни1. Такие hyperpermeability наблюдается, например, на участках ткани травмы, воспаления, в опухоли, во время сепсиса, в глазах с неоваскулярной болезни или в мозг и сердце, когда ишемии тканей происходит из-за инсульта или инфаркта миокарда, соответственно 5 , 6 , 7 , 8. когда хронически повышенным, hyperpermeability приводит к отек, который в свою очередь вызывает повреждение тканей, таких как потеря зрения глаз болезни9. Таким образом моделирование ответ сосудистой hyperpermeability желательно, для понимания механизмов, которые повышают проницаемость эндотелия и проверить эффективность агентов, предназначенных для подавления этого.
Assay км является устоявшейся, часто используемые и относительно простой метод, который меры сосудистые утечки в естественных условиях в качестве суррогата измерения сосудистой hyperpermeability. Даже несмотря на то, что это не принимать во внимание, усугубляющие факторы, которые могут увеличить сосудистые утечки независимо от регулирования эндотелиальный барьер, например артериального давления или поток крови, пробирного км считается, что обеспечивают надежный метод для оценки проницаемость модулирует активность веществ и определения сигналов посредников, которые способствуют их деятельности. Соответственно, пробирного км был неотъемлемой частью многочисленные исследования, которые выявили посредников сосудистой hyperpermeability и их механизмы действий10,11,12,13, 14,15, таких как Сосудистый эндотелиальный фактор роста VEGF-A, первоначально была определена в качестве коэффициента проницаемости сосудов VPF16.
Первоначально разработанный мили и мили для изучения сосудистой проницаемости в морских свинок17, их пробирного была впоследствии адаптирована к с помощью мышей, которые в настоящее время модель организма выбора для выяснения молекулярных механизмов сосудистой проницаемости правила из-за их изысканный пригодности для генетических манипуляций. Вкратце Эванс синий краситель внутривенно вводят в взрослых мышей и позволило распространить на 30 минут (рис. 1). Проницаемость-возбудителей против управления транспортного средства затем intradermally вводят в нескольких сайтов на противоположных склонах мыши, чтобы побудить сосудистые утечки (рис. 1). Следовательно альбумин прыгните Эванс синий краситель extravasates и накапливается в дерму (рис. 1). После гуманно забой мыши, Эванс синий извлекается из дермы и уровень сосудистые утечки рассчитывается как отношение теста вещество – для транспортных средств индуцированной оптической плотности (рис. 2).
Начиная с его первого описания в 1952 году17миль пробирного предоставил исследователей относительно быстрый, простой и надежный метод для изучения молекулярных механизмов сосудистой hyperpermeability. К примеру пробирного км был использован для тестирования способности и/или потенции различных агентов побудить hyperpermeability19,,2021 или проверить эффективность блокирующих агентов hyperpermeability8 ,22,23. В качестве другого примера агенты, которые индуцируют сосудистой проницаемости были протестированы в генетически измененных мышей и их помёте контроля для определения требования специфических рецепторов и сигнал преобразователя белков для лиганд индуцированной hyperpermeability ответы10,11,12,13,14,15,,2023. Несколько модифицированные версии пробирного км с тех пор были использованы, например в отношении трассировщик используется. Таким образом синий Эванс был заменен в некоторых исследованиях с флуоресцировани обозначенного декстраны разных размеров или микросферы11,13.
Основным преимуществом км пробирного над другими анализов для изучения сосудистой hyperpermeability механизмов является что он сравнительно легко выполнить и не требует дорогого оборудования. Кроме того, как в естественных условиях технику, пробирного модели сосудистые утечки в контексте нетронутыми кровеносных сосудов, в отличие от измерения утечки через в vitro assays такие как транс хорошо анализов потока или транс эндотелиальной электрического сопротивления ( ТЕЕР) анализов, которые сосредоточены, исключительно, на эндотелиальных монослоя. Альтернативные в vivo анализов сосудистой hyperpermeability может отличаться от пробирного км, описанных здесь, используя другой поставки маршрут для hyperpermeability заставить агент или анализируя сосудистые утечки на разных сайтах, для Пример системного доставки агента через Вену хвост, следуют сосудистые утечки экзамен в легкие и трахею11,,1315. Одно ограничение анализа км является что внутрикожного введения некоторых агентов может в принципе, также влияют на артериальное давление и потока в дополнение к нарушению эндотелиальный барьер и, таким образом, также косвенно влиять сосудистой проницаемости. Тем не менее, этот assay недавно было показано для измерения проницаемости сосудов, вызванный VEGF-A независимо от воздействия на15системного артериального давления. Другое ограничение анализа км является, что сосудистые кровати в разных тканях могут реагировать по-разному проницаемость содействие агентов и результаты, полученные с Пробирной миль в коже таким образом, не могут представителя, например, того, что происходит в легких и мозга.
Возраст и вес животного может повлиять утечки, наблюдается в assay км. Чтобы свести к минимуму эффект этих переменных, исследователи должны использовать однопометники или аналогичным образом размера и возрасте мышей как элементы управления. При оценке мутантов мыши для определенного гена интереса, мышей должны создаваться через гетерозиготных против гетерозиготных разведения стратегии и wildtype однопометники, используемых как элементы управления. Кроме того желательно использовать анестетики быстро обратимых газа, таких как изофлюрановая, чтобы избежать вазоконстрикция, который был описан для некоторых обезболивающий препарат через парентеральной инъекции24,25. Инъекции Эванс синий краситель в Вену боковых хвост мыши является важным шагом в этом протоколе и значительно влияют на качество данных и эксперимент. Таким образом исследователи должны быть компетентными в выполнении инъекции Вену хвост и будет скорее всего нужно предварительного опыта и практики до начала анализа мили эксперимент. Кроме того исследователи можно использовать другие внутривенного маршруты доставить Эванс синий, как ретро орбиталь инъекций, если они знакомы с ним. Внутрикожные инъекции проницаемость поощрение решения могут вызвать агента независимые повреждения кожи. Таким образом подкожные инъекции не должен превышать 20 мкл в томе следует всегда осуществляться в присутствии ингибитора гистамина и нормализации транспортного средства управления инъекции.
Assay км был использован многими исследователями для оценки компонентов сигнальный путь VEGF-А, к примеру, потому что VEGF-A-индуцированной проницаемости сосудов вызывает асцит в раковых больных16 и видение уменьшается отек в нескольких неоваскулярной болезни глаз7. Таким образом мы и другие использовали пробирного км для сравнения VEGF-A индуцированных сосудистые утечки в мышей, которые были генетически изменены отсутствия конкретных компонентов VEGF-А сигнальный Каскад12,13,14, 15 , 20 , 23. нашего недавнего исследования, используя этот подход показал, что основные патологические изоформы VEGF-A, VEGF165, сигналы через комплекс VEGFR2 и NRP1, в котором NRP1 цитоплазматических доменов способствует ABL киназы опосредованной активации SRC семьи киназ чтобы вызвать hyperpermeability ответ14. VEGFA также способствует росту кровеносных сосудов и таким образом, можно терапевтически восстановления кровотока к ишемии тканей, если свою hyperpermeability деятельность может быть специально тормозится. Исследования, изучение молекулярного механизма, который Бычков VEGF-A ответы сосудистый эндотелиальных клеток к сосудистой hyperpermeability может таким образом, определить пути, которые могут управляться избирательно подавляют патологических VEGF-A индуцированной отек заболеваний таких как рак или ишемической болезни глаз. Assay км несомненно будет продолжать быть полезным методом для подкрепления этих и многих других видов функциональных исследований для выяснения молекулярно регуляторы и эффекторы сосудистой hyperpermeability.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Лаура Denti, Валентины семья Senatore и сотрудники отдела биологических ресурсов в UCL Института офтальмологии для помочь с мыши животноводства и Камилла Charoy для технической поддержки. Эта работа была поддержана грантом Совета медицинских исследований (MR/N011511/1) C. Ruhrberg и Британский фонд PhD сердце студенчества в ДжТ дерзкий (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |