Qui, presentiamo un protocollo per misurare la perdita vascolare indotta dalla somministrazione intradermica di agenti di promozione di permeabilità nella pelle murina. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare la capacità delle molecole di promuovere o inibire la perdita vascolare o per studiare i meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare.
La funzione primaria dell’endotelio vascolare negli organismi vertebrati è di servire come una barriera tra il sangue e ogni tessuto del corpo, per cui la permeabilità dell’endotelio a cellule del sangue, macromolecole del plasma e l’acqua può essere adattata secondo il bisogno fisiologico. In alcune malattie, citochine e fattori di crescita vengono rilasciati che mirano la barriera endoteliale per aumentare transitoriamente la permeabilità vascolare; Tuttavia, la loro presenza prolungata può causare hyperpermeability vascolare cronica e quindi danneggiano il tessuto dell’edema. Il dosaggio di Miles è una tecnica di in vivo che permette ai ricercatori di studiare hyperpermeability vascolare attraverso la misurazione di proxy di perdita vascolare. Qui, forniamo un protocollo dettagliato su come eseguire questa procedura nel topo, che è l’organismo di modello più ampiamente usato per studiare la patologia e fisiologia dei mammiferi. La procedura prevede l’iniezione endovenosa di blu di Evans per etichettare l’albumina circolante seguita da multiple iniezioni intradermiche di agenti d’induzione permeabilità e soluzioni di controllo del veicolo in opposti fianchi del mouse. Di conseguenza, colorante blu di Evans perde gradualmente nel derma, dove si accumula e può essere estratta per quantificazione come perdita indotta dall’agente d’induzione permeabilità rispetto al veicolo. Il dosaggio di Miles può essere eseguito in wild-type o geneticamente modificati modelli murini e può essere combinato con drug administration per lo studio dei meccanismi molecolari che regolano la permeabilità vascolare e identificano gli agenti/bersagli in grado di indurre o il blocco hyperpermeability.
La funzione primaria del sistema cardiovascolare è quello di consentire il trasferimento di gas, nutrienti e prodotti di scarto tra la circolazione e tessuti in tutti gli organi. Vasi sanguigni hanno organo-specifici livelli di permeabilità basale per consentire tali scambi1. Per esempio, i vasi sanguigni nel rene sono altamente permeabili, mentre la barriera ematoencefalica costituisce un’interfaccia altamente impenetrabile, stretto2,3,4. Le cellule endoteliali che formano il rivestimento interno dei vasi sanguigni forniscono una barriera fisica tra la circolazione e tessuti sottostanti e regolano la permeabilità vascolare in un modo di organo-specific. Tuttavia, determinati stimoli causano un crollo parziale della barriera endoteliale per aumentare lo stravaso di fluido dalla circolazione nell’interstizio sopra i livelli basali di1. Tale hyperpermeability è osservata, per esempio, ai luoghi del trauma dei tessuti, nell’infiammazione, nei tumori, durante la sepsi, in occhi con malattia neovascular o nel cervello e nel cuore, quando ischemia del tessuto si verifica a causa di un ictus o un infarto miocardico, rispettivamente 5 , 6 , 7 , 8. quando cronicamente elevati, hyperpermeability conduce all’edema, che a sua volta provoca danni ai tessuti, come la perdita della visione nell’occhio malattia9. Così, la modellazione della risposta vascolare hyperpermeability è auspicabile per la comprensione dei meccanismi che aumentano la permeabilità endoteliale e per testare l’efficacia degli agenti progettati per inibire questo.
Il dosaggio di Miles è una tecnica ben consolidata, comunemente usata e relativamente semplice che misura perdita vascolare in vivo come una misura di surrogato del hyperpermeability vascolare. Anche se essa non tener conto ad aggravare i fattori che possono aumentare la perdita vascolare indipendentemente dal regolamento barriera endoteliale, quali pressione sanguigna o flusso sanguigno, il dosaggio di Miles è generalmente pensato per fornire un metodo affidabile per valutare la permeabilità-modulazione attività di sostanze e identificare i mediatori di segnalazione che promuovono la loro attività. Di conseguenza, il dosaggio di Miles è stato parte integrante di numerosi studi che hanno identificato mediatori di hyperpermeability vascolare e dei loro meccanismi di azione10,11,12,13, 14,15, ad esempio il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF-A che è stato originariamente identificato come il fattore di permeabilità vascolare VPF16.
Originariamente sviluppato da miglia e miglia per studiare la permeabilità vascolare in cavie17, loro dosaggio è stato successivamente adattato all’utilizzo di topi, che sono ora l’organismo modello di scelta per delucidare i meccanismi molecolari della permeabilità vascolare regolamento a causa della loro idoneità squisita di manipolazione genetica. Brevemente, colorante blu di Evans è per via endovenosa iniettato in topi adulti e ammessi a circolare per 30 minuti (Figura 1). Agenti d’induzione permeabilità contro controllo veicolo quindi vengono iniettati per via intradermica in più siti su opposti fianchi del mouse per indurre la perdita vascolare (Figura 1). Di conseguenza, colorante blu di Evans albumina extravasates e si accumula nel derma (Figura 1). Dopo umanamente abbattimento il mouse, blu di Evans è estratta dal derma e il livello di perdita vascolare calcolato come il rapporto del test al veicolo-indotte da sostanze di densità ottica (Figura 2).
Dalla sua prima descrizione nel 195217, il dosaggio di Miles ha fornito i ricercatori con un metodo relativamente rapido, semplice e affidabile per lo studio dei meccanismi molecolari di hyperpermeability vascolare. Ad esempio, il dosaggio di Miles è stato utilizzato per testare la capacità e/o potenza di diversi agenti per indurre hyperpermeability19,20,21 o per testare l’efficacia di hyperpermeability blocco agenti8 ,22,23. Come altro esempio, gli agenti che inducono la permeabilità vascolare sono stati testati in topi geneticamente modificati ed i loro comandi littermate per determinare i requisiti di specifici recettori e proteine per hyperpermeability indotta da legante di trasduzione del segnale le risposte10,11,12,13,14,15,20,23. Diverse versioni modificate del dosaggio Miles da allora sono state usate, ad esempio per quanto riguarda il tracciante utilizzato. Così, blu di Evans è stato sostituito in alcuni studi con fluorescenza-labeled destrani di diverse dimensioni o microsfere11,13.
Il vantaggio principale del dosaggio Miles su altri saggi per studiare i meccanismi vascolari hyperpermeability è che è relativamente facile da eseguire e non richiede costose attrezzature. Inoltre, come tecnica di in vivo , questa perdita vascolare di modelli di analisi nel contesto dei vasi sanguigni intatti, al contrario di misurazione perdita attraverso in vitro dosaggi come trans bene le analisi di flusso o trans endoteliale resistenza elettrica ( Saggi TEER), che si concentrano, esclusivamente, sul monostrato endoteliale. I saggi alternativi in vivo di hyperpermeability vascolare possono differire del dosaggio di Miles qui descritto utilizzando un percorso di consegna diverso per l’agente d’induzione hyperpermeability o analizzando la perdita vascolare in siti diversi, per esempio di consegna sistemica di un agente tramite vena caudale seguita da esame di perdita vascolare nei polmoni o la trachea11,13,15. Una limitazione del dosaggio Miles è che l’iniezione intradermica di determinati agenti potrà, in linea di principio, anche influenzare la pressione sanguigna e il flusso oltre alla rottura della barriera endoteliale e, pertanto, anche indirettamente influisce sulla permeabilità vascolare. Tuttavia, questo test recentemente è stato indicato per misurare la permeabilità vascolare indotta da VEGF-A indipendentemente dagli effetti sulla pressione arteriosa sistemica15. Un’altra limitazione del dosaggio Miles è che letti vascolari in tessuti differenti possono rispondere diversamente a permeabilità-Promozione agenti e i risultati ottenuti con un dosaggio di Miles nella pelle possono, quindi, non essere rappresentante, ad esempio, di ciò che avviene nella polmone o il cervello.
Età e il peso dell’animale possono influenzare la perdita osservata nell’analisi della Miles. Per ridurre al minimo l’effetto di queste variabili, i ricercatori devono utilizzare littermates o similmente dimensioni e topi come controlli invecchiati. Quando si valutano i mutanti del topo per un particolare gene di interesse, topi devono essere generati attraverso un eterozigote contro littermates di strategia e wildtype eterozigoti allevamento utilizzati come controlli. Inoltre, si consiglia di utilizzare anestetici gas rapidamente reversibili, come isoflurano, per evitare di vasocostrizione, che è stato descritto per qualche farmaco anestetico somministrato tramite iniezioni parenterali24,25. L’iniezione di blu di Evans in vena caudale laterale del mouse è un passo fondamentale in questo protocollo e può notevolmente influenzare la qualità dei dati e esperimento. Così, i ricercatori devono essere competenti nell’esecuzione di iniezioni di vena di coda e sarà probabilmente bisogno di precedente esperienza o pratica prima di iniziare che le miglia saggio sperimentare. In alternativa, i ricercatori potrebbero utilizzare altre vie endovenosa per recapitare Evans blu, come l’iniezione di retro-orbitale se essi vengono vissuti con esso. Iniezione intradermica di permeabilità-promuovere soluzioni possono causare danni di agente indipendente per la pelle. Pertanto, iniezioni intradermiche non deve superare i 20 µ l di volume, dovrebbero sempre essere effettuate in presenza dell’inibitore dell’istamina e normalizzate a iniezioni di controllo del veicolo.
Il dosaggio di Miles è stato utilizzato da molti ricercatori per valutare componenti il VEGF-A della via di segnalazione, ad esempio, perché permeabilità vascolare indotta da VEGF-una causa di ascite nel cancro pazienti16 e visione-alterando l’edema in parecchi neovascolare occhio malattia7. Così, noi ed altri abbiamo usato l’analisi di Miles per confrontare il VEGF-A perdita vascolare indotta in topi geneticamente modificati per la mancanza di componenti specifici del VEGF-A segnalazione cascata12,13,14, 15 , 20 , 23. il nostro studio recente utilizzando questo approccio ha rivelato che l’isoforma patologica principale di VEGF-A, VEGF165, segnali attraverso un complesso di VEGFR2 e NRP1, in cui il dominio citoplasmatico di NRP1 promuove l’attivazione di chinasi-mediata di ABL di chinasi della famiglia SRC per evocare una risposta di hyperpermeability14. VEGFA, inoltre, promuove la crescita dei vasi sanguigni e potrebbe, pertanto, essere utilizzato terapeuticamente per ripristinare il flusso sanguigno ai tessuti ischemici se sue attività hyperpermeability potrebbe essere specificamente inibita. Ricerca delucidare il meccanismo molecolare che dirige il VEGF-A risposte delle cellule endoteliali vascolari verso hyperpermeability vascolare potrebbe, pertanto, individuare percorsi che possono essere manipolate in modo selettivo per inibire patologico VEGF-A ha indotto l’edema nelle malattie, come il cancro o malattia ischemica dell’occhio. Il dosaggio di Miles senza dubbio continuerà a essere un metodo utile per sostenere questi e molti altri tipi di studi funzionali per delucidare molecolari regolatori ed effettori della hyperpermeability vascolare.
The authors have nothing to disclose.
Si ringrazia Laura Denti, Valentina Senatore e il personale dell’unità risorse biologiche presso la UCL Institute of Ophthalmology per aiutare con allevamento del mouse e Camille Charoy per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione del Medical Research Council (MR/N011511/1) a C. Rührberg e un British Heart Foundation PhD studentship di J.T. Brash (FS/13/59/30649).
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |