Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die vaskuläre Leckage induziert durch intradermale Verabreichung von Durchlässigkeit fördern Wirkstoffen in der murinen Haut zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um festzustellen, die Fähigkeit von Molekülen zu fördern bzw. hemmen vaskulären Leckage oder die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren.
Die primäre Funktion des Gefäßendothels in vertebrate Organismen ist, dienen als eine Barriere zwischen Blut und jedes Gewebe des Körpers, wobei die Permeabilität des Endothels, Blutzellen und Plasma Makromoleküle Wasser entsprechend angepasst werden kann die physiologische Notwendigkeit. Bei bestimmten Krankheiten werden Zytokine und Wachstumsfaktoren freigesetzt, die auf die endotheliale Barriere um vaskulären Permeabilität vorübergehend zu erhöhen; jedoch kann ihre verlängerte Anwesenheit chronische vaskuläre Hyperpermeability und damit Gewebe beschädigen Ödeme verursachen. Meilen-Assay ist eine in Vivo -Technik, die Forscher, vaskuläre Hyperpermeability durch die Proxy-Messung der vaskulären Leckage zu studieren können. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Durchführen dieses Verfahrens in der Maus ist die am weitesten verbreitete Modellorganismus Säugetier-Physiologie und Pathologie zu studieren. Das Verfahren beinhaltet die intravenöse Injektion von Evans blau färben, die zirkulierenden Albumin, gefolgt von mehreren intradermale Injektionen von Durchlässigkeit-induzierende Wirkstoffe und Fahrzeug-Control-Lösungen in gegnerischen Flanken der Maus zu kennzeichnen. Infolgedessen Lecks Evans blauen Farbstoff allmählich in die Dermis, wo es sammelt und zur Quantifizierung als Leckage induziert durch die Durchlässigkeit-induzierende Agent bezogen auf das Fahrzeug extrahiert werden kann. Meilen-Assay in Wildtyp durchgeführt werden kann oder genetisch veränderte Mausmodelle und sind kombinierbar mit Medikamentengabe Molekulare Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren und Agenten/Ziele in der Lage, Induktion oder Sperrung zu identifizieren Hyperpermeability.
Die primäre Funktion des Herz-Kreislauf-Systems soll die Übertragung von Gasen, Nährstoffe und Abfallprodukte zwischen der Zirkulation und Gewebe in allen Organen zu ermöglichen. Blutgefäße haben organspezifischen basale Durchlässigkeit für solchen Austausch1zu ermöglichen. Zum Beispiel sind die Blutgefäße in der Niere hochpermeablen, während die Blut-Hirn-Schranke eine enge, sehr undurchdringliche Oberfläche2,3,4 bildet. Die Endothelzellen, die die innere Auskleidung der Blutgefäße bilden bieten eine physische Barriere zwischen dem Blutkreislauf und darunter liegende Gewebe und vaskulären Permeabilität in Organ-spezifische Weise zu regulieren. Jedoch führen bestimmte Reize eine partielle Aufschlüsselung der endotheliale Barriere um das Fluid Extravasation aus dem Kreislauf in das Interstitium über den basalen Ebenen1zu erhöhen. Solche Hyperpermeability ist zum Beispiel beobachtet, an Standorten von Gewebetrauma, bei Entzündungen, Tumoren, bei Sepsis, in Augen mit neovaskulären Krankheit oder im Gehirn und im Herzen, tritt Gewebe Ischämie durch einen Schlaganfall oder einen Herzinfarkt, bzw. 5 , 6 , 7 , 8. wenn chronisch erhöht, Hyperpermeability führt zu Ödem, wodurch wiederum Gewebeschäden, z. B. Verlust der Sehkraft im Auge Krankheit9. Modellierung der vaskulären Hyperpermeability Antwort ist also wünschenswert für das Verständnis der Mechanismen, die endotheliale Durchlässigkeit zu erhöhen und die Wirksamkeit der Wirkstoffe entwickelt, um dies zu hemmen zu testen.
Die Meilen-Assay ist eine gut etablierte, häufig verwendete und relativ einfache Technik, die vaskuläre Leckage in Vivo als Surrogat Maß für vaskuläre Hyperpermeability misst. Obwohl es nicht berücksichtigen ist Compoundierung Faktoren, die vaskuläre Leckage unabhängig von endotheliale Barriere Verordnung, wie Blutdruck oder Durchblutung, erhöhen können die Miles-Assay wird allgemein angenommen, ermöglichen eine zuverlässige Methode zur Bewertung der Durchlässigkeit-Modulation der Aktivität der Substanzen und identifizieren die Signalisierung Vermittler, die ihre Tätigkeit zu fördern. Dementsprechend die Miles-Assay wurde integraler Bestandteil zahlreicher Studien, die Mediatoren der vaskulären Hyperpermeability und ihre Mechanismen der Aktion10,11,12,13, identifiziert haben 14,15, z. B. den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF-A, wurde ursprünglich als der vaskulären Permeabilität Faktor VPF16identifiziert.
Ursprünglich entwickelt von Meilen und Meilen, vaskulären Permeabilität in Meerschweinchen17zu studieren, war ihre Assay nachträglich angepasst, mit Mäusen, die jetzt den Modellorganismus der Wahl, um die molekulare Mechanismen der vaskulären Permeabilität zu erhellen Verordnung aufgrund ihrer exquisiten Eignung zur Genmanipulation. Kurz, ist Evans blauen Farbstoff intravenös in Erwachsenen Mäusen injiziert und durfte für 30 Minuten (Abbildung 1) zirkulieren. Permeabilität-induzierende Wirkstoffe gegen Fahrzeugkontrolle werden dann mikrodialysemembranen an mehreren Standorten an gegenüberliegenden Flanken der Maus induzieren vaskulären Leck (Abbildung 1) injiziert. Folglich, gebundenen Sie Albumin-Evans blauer Farbstoff extravasates und reichert sich in der Dermis (Abbildung 1). Nach menschlich Keulung der Maus, ist Evans blau aus der Dermis und die Höhe der vaskulären Leck berechnet als Verhältnis der Test Substanz -, Fahrzeug-induzierte optische Dichte (Abbildung 2).
Seit seiner Erstbeschreibung im Jahr 195217hat die Miles-Assay Forscher eine relativ schnelle, einfache und zuverlässige Methode zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der vaskulären Hyperpermeability gegeben. Zum Beispiel wurde die Miles-Assay zur testen die Fähigkeit und/oder Wirksamkeit von verschiedenen Agenten induzieren Hyperpermeability19,20,21 oder testen Sie die Wirksamkeit von Hyperpermeability blockierenden Agenten8 ,22,23. Ein weiteres Beispiel sind Agenten, die vaskuläre Permeabilität führen in genetisch veränderten Mäusen und ihren stellt Steuerelemente zur Ermittlung der Anforderungen an spezifische Rezeptoren und Proteine für Liganden-induzierte Hyperpermeability transducing Signal getestet worden Antworten10,11,12,13,14,15,20,23. Mehrere modifizierte Versionen des Miles Assays haben seit verwendet worden, zum Beispiel in Bezug auf die Tracer verwendet. So wurde Evans Blue in einigen Studien mit Fluoreszenz-markierten Dextrans verschiedener Größen oder Mikrosphären11,13ersetzt.
Der Hauptvorteil des Miles Assays gegenüber anderen Assays für vaskuläre Hyperpermeability Mechanismen zu untersuchen ist, dass es vergleichsweise einfach durchzuführen und keine teure Ausrüstung erfordert. Darüber hinaus als in Vivo Technik, dieser Assay Modelle vaskulären Leckage im Rahmen von intakten Blutgefäßen assays im Gegensatz zur Messung von Leckagen durch in-vitro- wie z. B. Trans Flussmittel Assays oder Trans endotheliale elektrischen Widerstand (gut TEER) Assays, die ausschließlich, auf die endotheliale monomolekularen Film konzentrieren. Die alternative in-Vivo -Assays der vaskulären Hyperpermeability abweichen von Miles Assays mithilfe eine abweichende Lieferanschrift Route für den Hyperpermeability-induzierende Agenten oder durch die Analyse von vaskulären Leckage an verschiedenen Standorten, für die hier beschriebenen Beispiel durch systemische Lieferung eines Agenten über die Rute Vene, gefolgt von vaskulären Leckage Prüfung in die Lunge oder Luftröhre11,13,15. Eine Einschränkung des Miles Tests ist, dass die intradermale Injektion von bestimmten Agenten kann im Prinzip auch Einfluss auf Blutdruck und fließen neben endotheliale Barriere Störung und, deshalb, auf vaskulären Permeabilität auch indirekt. Trotzdem dieser Assay vor kurzem wurde gezeigt, dass vaskuläre Permeabilität durch induzierte Messen VEGF-A unabhängig von Auswirkungen auf die systemischen Blutdruck15. Eine weitere Einschränkung des Miles-Assays ist, dass vaskuläre Betten in verschiedenen Geweben unterschiedlich zu Durchlässigkeit fördernde Mittel und Ergebnisse, die mit einem Miles-Assay in der Haut können daher nicht repräsentativ sein, zum Beispiel reagieren können der Vorgänge in der Lunge oder Gehirn.
Alter und Gewicht des Tieres beeinflussen die Leckage in der Miles-Assay beobachtet. Um die Wirkung dieser Variablen zu minimieren, Forscher verwenden wurfgeschwistern oder ähnlich Größe und Alter Mäuse als Kontrollen. Maus-Mutanten für ein bestimmtes Gen von Interesse zu beurteilen, sollten Mäuse durch eine heterozygote versus heterozygot Zucht Strategie und Wildtyp wurfgeschwistern verwendet als Steuerelemente generiert werden. Darüber hinaus ist es ratsam schnell reversibel Gas Anästhetika, wie Isoflurane, Vasokonstriktion, die für einige betäubende Medikament verabreicht über parenterale Injektionen24,25beschrieben worden ist, zu vermeiden. Die Injektion von Evans blauen Farbstoff in die Maus seitlich Heck Vene ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll und kann großen Einfluss auf die Qualität des Experiments und Daten. So Forscher müssen bei der Durchführung von Tail Vene Spritzen zuständig sein und wird wahrscheinlich brauchen Vorkenntnisse oder Praxis vor Beginn der Meilen assay experimentieren. Alternativ können Forscher andere intravenöse Strecken liefern Evans blau, wie Retro-Orbital-Injektion, wenn sie Erfahrung mit ihm haben. Intradermale Injektion der Förderung der Durchlässigkeit Lösungen Agent-unabhängige Schäden an der Haut verursachen können. Daher sollte intradermale Injektionen sollte nicht mehr als 20 µl Volumen, immer im Beisein der Histamin-Inhibitor durchgeführt und auf Fahrzeug-Kontrolle-Injektionen normalisiert.
Meilen-Assay wurde von vielen Forschern verwendet, um Komponenten der VEGF-A Signalweg, z. B. zu bewerten weil VEGF-A-induzierten vaskulären Permeabilität Aszites bei Krebs Patienten16 und Vision beeinträchtigen Ödem in mehreren neovaskulären verursacht Auge Krankheit7. So haben wir und andere die Miles-Assay verwendet VEGF-A induzierten vaskulären Leckage bei Mäusen zu vergleichen, die gentechnisch verändert wurden, um bestimmte Komponenten des VEGF-A Signalisierung Kaskade12,13,14, fehlt 15 , 20 , 23. unsere aktuelle Studie, die mit dieser Methode ergab, dass die wichtigsten pathologische VEGF-A-Isoform, VEGF165, durch einen Komplex von VEGFR2 und NRP1 signalisiert, in denen die NRP1 cytoplasmatische Domäne die ABL-Kinase-vermittelte Aktivierung des SRC Familie Kinasen fördert eine Hyperpermeability Antwort14hervorrufen. VEGFA fördert Wachstum von Blutgefäßen und könnte daher therapeutisch zur Blutfluss zu ischämischen Gewebe wiederherzustellen, wenn seine Hyperpermeability Tätigkeit spezifisch gehemmt werden könnte verwendet werden. Aufklärung der molekularen Mechanismen, die VEGF-A Antworten von vaskulären Endothelzellen in Richtung vaskuläre Hyperpermeability steuert Forschung könnte daher Wege identifiziert werden, die gezielt manipuliert werden können, um pathologische VEGF-A induzierte Ödeme hemmen bei Krankheiten wie Krebs oder ischämischen Augenkrankheit. Meilen-Assay wird zweifellos weiterhin eine hilfreiche Methode, um untermauern diese und viele andere Arten von funktionellen Untersuchungen zur molekularen Regulatoren und Effektoren der vaskulären Hyperpermeability aufzuklären.
The authors have nothing to disclose.
Wir bedanken uns bei Laura Denti, Valentina Senatore und die Mitarbeiter des Referats biologische Ressourcen am UCL Institute of Ophthalmology für Hilfe bei Maus Haltung und Camille Charoy für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Medical Research Council (MR/N011511/1), C. Ruhrberg und eine British Heart Foundation PhD-Zugehörigkeit, j.t. Brash (FS/13/59/30649) unterstützt.
Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml – 8 mm – 30G | BD | 324826 | |
Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
Mouse restrainer | |||
Heat chamber | |||
Hair clippers | |||
Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
Scalpal | |||
Blunt scissor | |||
Forceps | |||
Eppendorf tubes | |||
Heatblock | |||
Cork board | |||
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |