Hücre dışı veziküller (EVs) kanser kaynaklı direkt enjeksiyon kemik iliği tümör ilerleme destekleyen yeniden programlama için yol açar; Ancak, bu etkinin hangi hücrelerin aracılık belli değildir. Burada, biz EV-aracılı tümör Mezenkimal Kök hücre (MSC) etkileşimleri vivo içindearaştırmak için adım adım bir protokol için EV eğitimli MSCs metastaz içinde çok önemli bir rol açığa tanımlamak.
Tümör microenvironment içinde ikamet veya işe Mezenkimal Kök hücre (MSCs) birden çok kanser türü Malign ilerlemesinde katkıda bulunur. Belirli çevre sinyalleri etkisi altında bu yetişkin kök hücreler lider hızlandırılmış tümör büyüme ve metastaz parakrin arabulucu serbest bırakabilirsiniz. Tümör ve MSCs arasında çapraz karışma tanımlama kanser ilerleme yatan mekanizmaları anlamak ve terapötik müdahale için yeni hedefler belirlemek için birincil önem taşımaktadır.
Kanser hücrelerinin derinden hedef hücreler tümör microenvironment veya uzak sitelerdeki davranışını etkileyebilir ekstraselüler veziküller (EVs), yüksek miktarlarda üretmek. Tümör EVs fonksiyonel biomolecules inflamatuar RNA’ların ve stromal hücreler kanser hücrelerinin metastatik davranış geliştirmek için veya önceden metastatik niş oluşumunda katılmak için eğitmek olabilir (onko) proteinler, dahil olmak üzere, alın. Bu makalede, belirli tümör ve Mezenkimal Kök hücreler arasındaki EV-aracılı crosstalk değerlendirilmesi sağlayan bir preklinik kanser fare modeli geliştirilmesi açıklar. İlk olarak, arıtma ve tümör salgılanan EVs karakterizasyonu ve EV içselleştirilmesi MSCs tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Biz o zaman yapmak MSC sitokin ifade profil İLETİMLERİNİZE değerlendirmek için çok katmanlı bir boncuk tabanlı immunoassay kullanımı kanseri EVs tarafından indüklenen. Son olarak, biz bir tümör-MSC etkileşim beyannamedir osteosarkom kollarındaki orthotopic xenograft fare modeli nesil göstermek ve EV eğitimli MSCs tümör büyüme ve metastaz oluşumu için katkı göstermek.
Bizim model nasıl kanser EVs tümör destekleyen bir ortam şekli tanımlamak ve abluka tümör ve MSCs arasındaki EV-aracılı iletişim kanser ilerleme engeller olup olmadığını değerlendirmek için fırsat sağlar.
Tümör microenvironment metastaz oluşumu ve tedavi1direnç gelişimi de dahil olmak üzere tumorigenesis ve kanser progresyon çoğu, hepsi değilse de, özelliği aktif olarak katılmaktadır. Bu diseksiyon tümör niş içinde meydana gelen karmaşık tümör-stroma etkileşimlerin izin preklinik orthotopic kanser fare modelleri gerekliliğini vurguluyor.
Tümör microenvironment birçok hücresel bileşenleri arasında Mezenkimal Kök hücre (MSCs) kuvvetle kanser meme kanseri, prostat kanseri, Beyin tümörleri, Multipl Miyelom ve osteosarkom2 gibi birden çok kanser türü ilerlemesinde katkıda ,3,4,5,6,7. MSCs kemik iliği, yağ dokusu, plasenta, göbek kordon kanı ve diğerleri de dahil olmak üzere çeşitli yetişkin ve fetal dokularda,8,9bulunan multipotent kök hücreler vardır. İnflamatuar sinyaller kanser üretilen cevaben, MSCs tümör siteleri doğru geçiş, tümör microenvironment dahil etmek ve sonuçta kanser destek hücreleri10ayırt etmek. Bu kanser ilişkili MSCs temel faktörler (Yani, büyüme faktörleri, kemokinler, sitokinler ve immünsupresif arabulucu) tümör hücreleri hem de çevresindeki stroma2, hareket tümör ilerleme sağlamak 3 , 11 , 12 , 13. kanser ilişkili MSCs tümör teşvik etkileri çok sayıda kanser modellerinde araştırdık iken, hangi tarafından tümör hücreleri yeniden programlamak kanser teşvik niş şekillendirmek için MSCs mekanizmalar kötü anlaşılır. Burada özellikle kemik kanseri hücreleri ve MSCs pro tumorigenic etkileşimini ekstraselüler veziküller (EVs) yolu ile çalışma sağlar orthotopic xenograft modelinin üretimi açıklayın.
EVs tümör ve stromal hücreler14arasındaki hücreler arası iletişim çok önemli arabulucu vardır. EVs kökenli proteinler, lipidler ve gen düzenlemesinde de dahil olmak üzere hücrenin fonksiyonel biomolecules taşırlar. Ekstrasellüler alanda serbest sonra bu veziküller çevreleyen hücreleri tarafından alınabilir veya kan veya lenf dolaşımını üzerinden uzak sitelere yapılan ve hedef hücre davranış derinden etkileyebilir. 15 , 16 , 17 Mesela kanser EVs stromal fibroblastlar tarafından alımını angiogenez destekleyen ve tümör büyüme vivo içinde18,19, endotel tarafından içselleştirilmesi hızlanan myofibroblast ayrımında neden olabilir hücreler tümör angiogenez teşvik etmek ve vasküler geçirgenliği16,20artırmak ve bağışıklık hücreleri ile etkileşim antitümör bağışıklık yanıtı21bastırılması için neden olabilir.
Son zamanlarda biz, osteosarkom, tümör hücreleri tumorigenic pro ve pro-metastatik fenotip elde etmek için MSCs sor EVs yüksek miktarda serbest bir kollarındaki orthotopic xenograft fare modeli kullanarak gösterilmiştir. Bu efekt (“Yüksek lisans eğitim” anılacaktır) MSC sitokin ifade profil dramatik bir değişim kaynaklanmaktadır ve bir terapötik İnterlökin-6 reseptörü (IL-6R) antikor7yönetimi tarafından engellenebilir. Çalışmalarımız kanser EVs MSC davranış, böylece microenvironment hedefli yaklaşımlar osteosarkom ilerleme durdurmak için bir gerekçe sağlayan çok önemli modülatörler olduğunu gösterdi. Burada, EV-aracılı tümör-MSC etkileşim içinde vivoaraştırmak için adım adım bir protokol açıklar. Bu model için tasarlanmıştır: 1) özellikle kanser EV kaynaklı değişikliklere MSC davranışının tümör microenvironment define, 2) nasıl bu etkileşim katkıda kemik tümörü büyümesi ve metastaz oluşumu ve 3) çalışma için engel olup olmadığını değerlendirmek EV-aracılı crosstalk vivo içinde kanser ilerleme engeller.
Hücre dışı veziküller (EVs) tümör salgılanan tümör destekleyici bir ortam oluşturmak için yerel ve uzak Mezenkimal hücreler fizyolojisi değiştirebilirsiniz. Burada diseksiyon tümör hücreleri arasında EV-aracılı etkileşimlerin sağlar osteosarkom preklinik fare modeli nesil tanımlamak ve (MSCs) vivoMezenkimal Kök hücreler. Biz insan tümör EV eğitimli MSCs osteosarkom xenografts şiddetle taşıyan farelerde sistemik enjeksiyon IL-6/STAT3 sinyal yolu7aktive edere…
The authors have nothing to disclose.
S.R. Baglio Associazione Italiana tarafından burs Cancro (AIRC) Co finanse la Ricerca sul Avrupa Birliği tarafından başına tarafından desteklenmiştir. Ayrıca, bu proje Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı Marie Sklodowska-Curie hibe sözleşmesi kapsamında hiçbir 660200 (S.R. Baglio) fon aldı.
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |