نموذج ماوس الإكلينيكية من أوستيوساركوما لتعريف الاتصال خارج الخلية حويصلة بوساطة بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة
Summary
الحقن المباشر حويصلات خارج الخلية المستمدة من السرطان (EVs) ويؤدي إلى إعادة برمجة نخاع العظام دعم تطور الورم؛ ومع ذلك، الخلايا التي تتوسط هذا التأثير غير واضح. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق EV بوساطة الخلايا الجذعية الورم الوسيطة (MSC) التفاعلات في فيفو، يكشف عن دور حاسم للمتعلمين EV MSCs في ورم خبيث.
Abstract
داخل ورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة المقيم أو المعينين (MSCs) التدرج الخبيث في العديد من أنواع السرطان. تحت تأثير إشارات بيئية محددة، يمكن أن تطلق هذه الخلايا الجذعية البالغة الوسطاء paracrine مما يؤدي إلى نمو الأورام المعجل وورم خبيث. تعريف الحديث المتبادل بين الورم و MSCs من الأهمية فهم الآليات الكامنة وراء تطور السرطان، وتحديد أهداف جديدة للتدخل العلاجي.
الخلايا السرطانية تنتج كميات كبيرة من حويصلات خارج الخلية (EVs)، التي يمكن أن تؤثر تأثيراً عميقا في سلوك الخلايا المستهدفة في ورم المكروية أو في مواقع بعيدة. ورم EVs أرفق الجزيئات الحيوية الوظيفية، بما في ذلك الكشف التحريضية والبروتينات (أونكو)، التي يمكن تعليم الخلايا اللحمية لتعزيز السلوك المنتشر من الخلايا السرطانية، أو للمشاركة في تشكيل المتخصصة قبل المنتشر. في هذه المقالة، يصف لنا تطوير نموذج الماوس السرطان الإكلينيكية التي تمكن من تقييم محدد للحديث EV بوساطة المتبادل بين الورم والخلايا الجذعية الوسيطة. أولاً، يصف لنا بتنقية وتوصيف المركبات الكهربائية يفرز الورم وتقييم استيعاب EV ب MSCs. ونحن ثم جعل استخدام المناعة على أساس حبة متعدد لتقييم تغيير التشكيل الجانبي التعبير سيتوكين MSC الناجمة عن السرطان المركبات الكهربائية. وأخيراً، توضح توليد نموذج الماوس إكسينوجرافت أورثوتوبيك طرحه أوستيوساركوما أن يلخص التفاعل الورم-ماجستير، وإظهار مساهمة المتعلمين EV MSCs لتشكيل الورم النمو وورم خبيث.
لدينا نموذج يتيح الفرصة لتحديد كيفية تشكيل المركبات الكهربائية السرطان بيئة داعمة للورم، وتقييم ما إذا كان حصار الاتصالات EV بوساطة بين الورم و MSCs يمنع تطور مرض السرطان.
Introduction
وورم المكروية تشارك بنشاط في معظم، أن لم يكن كلها، جوانب التقدم توموريجينيسيس والسرطان، بما في ذلك تشكيل ورم خبيث وتطوير المقاومة للتداوي1. هذا يؤكد الحاجة إلى نماذج الماوس سرطان أورثوتوبيك الإكلينيكية التي تسمح لتشريح ستروما الورم معقدة التفاعلات التي تحدث في مكانة الورم.
بين العديد من المكونات الخلوية لورم المكروية، تسهم الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) بشدة في تطور السرطان في العديد من أنواع السرطان مثل سرطان الثدي وسرطان البروستاتا، وأورام الدماغ، والورم النخاعي المتعدد و osteosarcoma2 ،3،،من45،،من67. MSCs هي الخلايا الجذعية البالغة multipotent الموجودة في أنسجة البالغين والجنين المختلفة، بما فيها نخاع العظام والأنسجة الدهنية، والمشيمة، ودم الحبل السري وغيرها8،9. استجابة لإشارات تحريضية تولد السرطان، ترحيل نحو مواقع الورم MSCs وإدماج وورم المكروية والتفريق في نهاية المطاف إلى خلايا السرطان دعم10. هذه MSCs المرتبطة بالسرطان توفر العوامل الأساسية (أي، عوامل النمو، المستقطبات، السيتوكينات، ووسطاء كآبته) لتطور الورم يتصرف على الخلايا السرطانية و سدى المحيطة بها2، 3 , 11 , 12 , 13-في حين تم التحقيق آثار تعزيز الورم MSCs المرتبطة بالسرطان في العديد من النماذج السرطان، الآليات التي بواسطتها برمجة الخلايا السرطانية MSCs على تشكيل السرطان-تعزيز مكانة هي غير مفهومة. هنا يصف لنا الجيل من طراز إكسينوجرافت أورثوتوبيك التي تسمح على وجه التحديد دراسة التفاعل برو ورمي بين خلايا سرطان العظام و MSCs عبر الحويصلات خارج الخلية (EVs).
المركبات الكهربائية حاسمة وسطاء الاتصال بين الخلايا بين الورم والخلايا اللحمية14. المركبات الكهربائية تحمل الجزيئات الحيوية الوظيفية من الخلية الأصلية، بما في ذلك البروتينات والدهون، والكشف التنظيمي. بعد إطلاق سراحه في الفضاء خارج الخلية، هذه الحويصلات يمكن أن تتناولها الخلايا المحيطة بها أو نقلها إلى مواقع بعيدة عن طريق الدم أو الدورة اللمفاوية، ويمكن أن تترك آثاراً عميقة على سلوك الخلية المستهدفة. 15 , 16 , 17 على سبيل المثال، ينتج الإقبال على السرطان المركبات الكهربائية بالخلايا الليفية stromal في تمايز أرومية دعم الأوعية والتعجيل بالورم النمو في فيفو18،19، استيعاب غشائي يمكن تنشيط الأوعية ورم الخلايا وزيادة نفاذية الأوعية الدموية16،20، والتفاعل مع الخلايا المناعية قد تؤدي إلى قمع استجابة مناعية انتيتومور21.
نحن مؤخرا أثبتت، باستخدام نموذج أورثوتوبيك طرحه ماوس إكسينوجرافت من أوستيوساركوما، أن الخلايا السرطانية الإفراج عن كميات كبيرة من المركبات الكهربائية التي تطالب MSCs للحصول النمط الظاهري برو الورمية والمحترفين المنتشر. هذا التأثير هو سبب تغيير جذري في الشخصية التعبير سيتوكين ماجستير (يشار إلى “ماجستير التعليم”)، ويمكن منع الإدارة من الأجسام المضادة مستقبلات انترلوكين-6 العلاجية (إيل-6R)7. عملنا أثبتت أن السرطان المركبات الكهربائية هي المغيرون حاسم لسلوك لجنة السلامة البحرية، مما يوفر الأساس منطقي للنهج المكروية التي تستهدف وقف التقدم osteosarcoma. هنا، يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للتحقيق في EV بوساطة الورم. ماجستير تفاعل في فيفو. ويهدف هذا النموذج إلى: 1) على وجه التحديد وتحديد التعديلات التي يسببها EV السرطان من السلوك ماجستير في ورم المكروية، 2) تقييم كيفية إسهام هذا التفاعل إلى نمو ورم العظام وتشكيل ورم خبيث، و 3) دراسة ما إذا كان التدخل في EV بوساطة الحديث المتبادل في فيفو يمنع تطور مرض السرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن يغير يفرز الورم حويصلات خارج الخلية (EVs) فسيولوجيا الخلايا الوسيطة المحلية والبعيدة إيجاد بيئة داعمة لورم. هنا يصف لنا توليد نموذج الماوس الإكلينيكية osteosarcoma يسمح التشريح EV بوساطة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) في فيفو. نظهر أن يعزز حقن النظامية ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد على زمالة بالإيطالية رابطة كل سول ريشيركا la كانكرو (التحكيمية) الممول من الاتحاد الأوروبي، Baglio ر. س. وبالإضافة إلى ذلك، تلقي هذا المشروع التمويل من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 برنامج البحوث والابتكار بموجب المنحة ماري سكلودوفسكا-كوري لا 660200 (إلى Baglio ر. س).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
