癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ プロトコルをについて説明します。
腫瘍微小環境の内で居住者又は採用した間葉系幹細胞 (MSCs) は、複数のがんの種類で悪性進展に貢献します。特定環境シグナルの影響を受けて、これらの成体幹細胞は加速の腫瘍の成長と転移につながるパラクリン メディエーターを解放できます。腫瘍と MSCs 間のクロストークの定義は、癌の進行のメカニズムを理解し、治療的介入のための新しいターゲットを識別する重要です。
がん細胞標的細胞腫瘍微小環境、遠隔部位の動作に深く影響を与える細胞小胞 (Ev) の大量に生産します。腫瘍の EVs は、炎症性の Rna と間質細胞のがん細胞の転移の特性を高めるためにまたは前転移のニッチ形成に参加することができます教育 (新規) タンパク質を含む生体機能分子を囲みます。この記事で EV を介したクロストーク腫瘍と間葉系幹細胞との間の具体的な評価を可能にする臨床癌のマウスモデルの開発について述べる.まず、浄化と腫瘍分泌 EVs のキャラクタリゼーションと MSCs によって EV 内面の評価について述べる。我々 はそれから作るがん EVs による多重ビード ベース イムノアッセイ MSC サイトカイン発現プロファイルの変化を評価するための使用。最後に、腫瘍 MSC の相互作用を繰り返す骨肉腫の発光同所性同種異種移植マウス モデルの生成を説明し、腫瘍の増殖と転移形成に MSCs を EV 教育の貢献を示します。
私たちのモデルは、がん EVs が腫瘍支援の環境を形づけるかを定義し、腫瘍と MSCs の EV を介したコミュニケーションの封鎖は癌の進行を防止するかどうかを評価する機会を提供します。
腫瘍微小環境は転移巣形成および1の治療に抵抗性の発達を含む腫瘍と癌の進行のすべてではない、ほとんどの面で積極的に参加しています。これは腫瘍のニッチ市場で発生している複雑な腫瘍間質相互作用の郭清ができる臨床同所性同種癌マウス モデルの必要性を強調します。
腫瘍微小環境の多くの細胞コンポーネント間で間葉系幹細胞 (Msc) は強く乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、多発性骨髄腫、骨肉腫2 など複数のがんの種類の癌の進行に貢献します。 ,3,4,5,6,7。MSCs は、8,9骨髄、脂肪組織、胎盤、臍帯血、およびその他を含むさまざまな成人および胎児組織に存在する多能性幹細胞です。がんによる炎症性シグナルに応答、MSCs は腫瘍のサイトへの移行、腫瘍微小環境に組み込む、最終的に細胞のがんサポート10に分化します。これら癌関連付けられている MSCs は腫瘍の進行腫瘍細胞と周囲間質2,の両方の演技 (すなわち、増殖因子、ケモカイン、サイトカイン、免疫メディエーター) 本質的な要因を提供します。3,11,12,13。 癌関連付けられている MSCs の発癌促進効果が多数癌モデルで検討されてきた中、腫瘍細胞は、癌促進のニッチを形成する MSCs を再プログラムするメカニズムはよく理解され。ここで具体的には細胞小胞 (Ev) を介して骨がん細胞と MSCs の pro 発癌性の相互作用の研究ができる直交異方性異種移植モデルの生成について述べる.
EVs は、腫瘍と間質細胞14細胞間コミュニケーションの重要なメディエーターです。EVs は、細胞が起源、蛋白質、脂質、規制 Rna などの生体機能分子を運ぶ。これらの小胞周囲の細胞によってとることができる、血液やリンパの循環を介して遠隔部位に運ばれるや標的細胞の行動に深く影響を与える細胞外スペースに解放されて、一度。15,16,17たとえば、間質線維芽細胞による癌 EVs の取り込みがあります myofibroblast 分化血管新生をサポートし、腫瘍成長体内18,19, 内皮細胞によって内面化を加速細胞が腫瘍の血管新生を刺激して血管透過性16,20、増加し、免疫細胞との相互作用は、21抗腫瘍免疫応答の抑制につながる可能性があります。
我々 は最近示した、骨肉腫、腫瘍細胞がプロ発癌性およびプロ転移性表現型を取得する MSCs を促す EVs を多量を解放する発光同所性同種異種移植マウス モデルを用いたします。この効果は MSC サイトカイン発現プロファイル (「MSC 教育」と呼ばれる)、の劇的な変化により、治療インターロイキン 6 受容体 (IL-6 r) 抗体7の管理によって防ぐことができます。私たちの仕事は、がん EVs が骨肉腫の進行を停止する微小環境をターゲットとしたアプローチの理論的根拠を提供、MSC の動作の重要な変調器であることを示した。ここで、EV を介した腫瘍 MSC の相互作用、生体内で調査するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる.このモデルは、するものです: 1) 特に腫瘍微小環境におけるがん EV 誘起 MSC の動作変更を定義する、2) 評価に干渉するかどうかこの相互作用が骨腫瘍の成長と転移巣の形成、3) 研究に貢献する方法生体内でEV を介したクロストークは、癌の進行を防ぎます。
腫瘍分泌細胞小胞 (Ev) は、腫瘍支援環境を生成するローカルと遠隔の間葉系細胞の生理学を変更できます。ここで腫瘍細胞の EV を介した相互作用の郭清ができる骨肉腫のマウスの前臨床モデルの生成について述べるし、間葉系幹細胞 (MSCs)生体内で。ひと腫瘍マウス骨肉腫異種移植片を強く付け EV 教育 MSCs の全身投与は、IL-6/STAT3 シグナリング経路7をアクティブにし?…
The authors have nothing to disclose.
S. r. バジーレは、欧州連合によって共同資金を供給 Cancro (AIRC) ラ Ricerca スルあたり Associazione イタリアーナで交わりによって支えられました。さらに、このプロジェクトはから資金を受けて欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム マリアスクウォドフスカ キュリー付与契約の下でない 660200 (s. r. バーリョ) に。
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |