Iniezione diretta di cancro-derivato di vescicole extracellulari (SVE) conduce alla riprogrammazione del midollo osseo, sostenendo la progressione del tumore; Tuttavia, le celle che mediano questo effetto è poco chiaro. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare EV-mediata di cellule staminali tumorali mesenchimali (MSC) interazioni in vivo, rivelando un ruolo cruciale per MSCs EV-educato in metastasi.
All’interno del microambiente tumorale, residente o reclutate cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuire alla progressione maligna in diversi tipi di cancro. Sotto l’influenza di specifici segnali ambientali, queste cellule staminali adulte possono rilasciare mediatori paracrini che conduce alla crescita accelerata del tumore e metastasi. Definire il crosstalk tra tumore e MSCs è di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base di progressione del cancro e identificare nuovi bersagli per interventi terapeutici.
Le cellule tumorali producono elevate quantità di vescicole extracellulari (EVs), che possono influire profondamente sul comportamento delle cellule bersaglio nel microambiente tumorale o ai luoghi distanti. Tumore EVs racchiudere biomolecole funzionali, tra cui infiammatoria RNA e proteine (onco), che possono educare le cellule stromal per migliorare il comportamento metastatico delle cellule tumorali o per partecipare alla formazione di nicchia pre-metastatico. In questo articolo, descriviamo lo sviluppo di un modello murino di cancro preclinica che consente la valutazione specifica del crosstalk EV-mediata tra tumore e cellule staminali mesenchimali. In primo luogo, descriviamo la purificazione e la caratterizzazione del tumore-secreto SVE e alla valutazione di interiorizzazione EV di MSCs. Quindi facciamo uso di un immunodosaggio basato su perlina multiplex per valutare l’alterazione del profilo di espressione di citochina MSC indotta da cancro EVs. Infine, ci illustrano la generazione di un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma che ricapitola l’interazione tumore-MSC e mostrare il contributo delle MSC EV-educato a formazione di crescita e la metastasi del tumore.
Il nostro modello offre l’opportunità di definire come cancro EVs forma un ambiente di supporto di tumore e per valutare se il blocco della comunicazione fra il tumore e MSCs EV-mediato previene la progressione del cancro.
Il microambiente tumorale partecipa attivamente in maggior parte, se non tutti, gli aspetti della progressione nella tumorigenesi e cancro, tra cui la formazione di metastasi e lo sviluppo della resistenza alla terapia1. Questo sottolinea la necessità di modelli murini di cancro preclinica orthotopic che consentono la dissezione delle interazioni tumore-stroma complesse che si verificano nella nicchia del tumore.
Tra i molti componenti cellulari del microambiente tumorale, cellule staminali mesenchimali (MSCs) contribuiscono fortemente alla progressione tumorale in diversi tipi di cancro come cancro al seno, cancro della prostata, i tumori cerebrali, mieloma multiplo e l’osteosarcoma2 ,3,4,5,6,7. MSCs sono cellule staminali multipotenti che si trovano in vari tessuti adulti e fetali, compreso il midollo osseo, il tessuto adiposo, placenta, sangue del cordone ombelicale e gli altri8,9. In risposta a segnali infiammatori generati dal cancro, MSCs migrare verso siti tumorali, incorporare nel microambiente tumorale e, in definitiva, differenziarsi in supporto di cancro cellule10. Questi MSCs cancro-collegati forniscono fattori essenziali (cioè, i fattori di crescita, chemochine, citochine e mediatori immunosoppressivi) per la progressione del tumore, che agiscono sia sulle cellule del tumore e lo stroma circostante2, 3 , 11 , 12 , 13. mentre gli effetti dipromozione di MSCs cancro-collegati sono stati studiati nei numerosi modelli di cancro, i meccanismi da cui le cellule del tumore riprogrammare MSCs per modellare una nicchia dipromozione sono capiti male. Qui descriviamo la generazione di un modello di xenotrapianto ortotopico che consente in particolare lo studio dell’interazione pro-cancerogeno tra cellule tumorali dell’osso e MSCs tramite vescicole extracellulari (EVs).
SVE sono mediatori cruciali della comunicazione intercellulare tra tumore e cellule stromali14. SVE trasportano biomolecole funzionale della cellula di origine, tra cui proteine, lipidi e RNA regolatori. Una volta rilasciato nello spazio extracellulare, queste vescicole possono essere preso dalle cellule circostanti o trasportato ai luoghi distanti tramite il sangue o la circolazione linfatica e possono influenzare profondamente il comportamento della cella di destinazione. 15 , 16 , 17 per esempio, l’assorbimento di cancro EVs dai fibroblasti stromal può provocare nella differenziazione dei miofibroblasti sostenendo l’angiogenesi e accelerando tumore crescita in vivo18,19, interiorizzazione di endoteliale cellule in grado di stimolare l’angiogenesi del tumore e aumentare la permeabilità vascolare16,20, e l’interazione con le cellule immunitarie potrebbe portare alla soppressione della risposta immunitaria antitumorale21.
Recentemente abbiamo dimostrato, utilizzando un modello murino di xenotrapianto bioluminescenti ortotopico di osteosarcoma, che le cellule del tumore rilasciano elevate quantità di EVs che richiedono MSCs per acquisire un fenotipo pro-cancerogena e pro-metastatico. Questo effetto è dovuto ad un drammatico cambiamento nel profilo di espressione di citochina MSC (denominato “Formazione MSC”) e può essere prevenuto con la somministrazione di un anticorpo di terapeutico del ricevitore interleukin-6 (IL-6R)7. Nostro lavoro ha dimostrato che il cancro SVE sono cruciali nella modulazione del comportamento MSC, così fornendo una spiegazione razionale per approcci mirati microambiente per fermare la progressione di osteosarcoma. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare l’interazione tumore-MSC EV-mediata in vivo. Questo modello è destinato a: 1) in particolare definire le alterazioni di EV-indotta di cancro di comportamento MSC nel microambiente tumorale, 2) valutare come questa interazione contribuisce alla crescita del tumore dell’osso e la formazione di metastasi e 3) Studio se interferiscono con la diafonia EV-mediata in vivo impedisce la progressione del cancro.
Tumore-secreto di vescicole extracellulari (SVE) possono alterare la fisiologia delle cellule mesenchimali locali e distanti per generare un ambiente favorevole del tumore. Qui descriviamo la generazione di un modello murino preclinico di osteosarcoma che consente una dissezione delle interazioni EV-mediata tra cellule tumorali e cellule staminali mesenchimali (MSCs) in vivo. Mostriamo che iniezione sistemica del tumore umano MSCs EV-educato in topi che sopportano gli xenotrapianti osteosarcoma fortemente promuo…
The authors have nothing to disclose.
S.R. Baglio è stato sostenuto da una borsa di studio di Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) co-finanziato dall’Unione europea. Inoltre, questo progetto ha ricevuto non finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione Marie Sklodowska-Curie 660200 (al S.R. Baglio).
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |